1.13: Culture d'explants de tissu neural

Les cultures d’explants servent de technique pour étudier le développement de populations cellulaires et de structures neurales spécifiques. Dans les expériences de neurosciences du développement, les explants sont des tissus neuraux excisés d’un embryon pour un développement continu in vitro. Ces cultures donnent aux chercheurs la possibilité de manipuler et de visualiser les tissus en développement d’une manière qui n’est pas possible in vivo. Cette vidéo présentera certains principes importants derrière le travail avec des tissus explantés, les procédures étape par étape pour deux approches de culture d’explants, ainsi que les applications de cette technique.

Avant d’entrer dans le vif du sujet, passons en revue quelques principes de base. Les explants peuvent être établis à partir d’un certain nombre d’organismes modèles et d’une variété de types de tissus. Généralement, les cultures sont créées en retirant soigneusement le tissu neural d’un embryon, en disséquant une région d’intérêt et en le plaçant dans un environnement artificiel.

Les mouchoirs peuvent également être coupés en fines feuilles et cultivés en « culture en tranches ». Parce que l’environnement de culture est conçu pour imiter les conditions in vivo de l’organe entier, cette stratégie de culture est souvent appelée « organotypique ».

Avant de commencer, assurez-vous de stériliser vos instruments avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, euthanasiez une souris enceinte en utilisant la méthode préférée de votre laboratoire. Ensuite, excisez chirurgicalement l’utérus et placez-le dans un tampon glacé. Transférez la boîte dans un microscope de dissection et retirez les embryons individuels de leur sac vitellin. Ensuite, isolez le cerveau, disséquez soigneusement votre région d’intérêt et transférez-la dans une boîte de culture contenant un milieu de culture. Les explants peuvent être entretenus dans un 37 ? C contenant 5 % de CO2 pendant quelques semaines en remplaçant 50 % du milieu tous les 2 à 3 jours.

La culture en coupe du tissu cérébral nécessite quelques étapes supplémentaires. Avant la section, le tissu est incrusté dans de l’agarose, qui fournit un soutien au tissu afin qu’il reste intact pendant qu’il est tranché. Pour ce faire, une solution d’agarose à faible point de fusion de 1,5 % est chauffée jusqu’à ce que l’agarose se dissolve. Ensuite, l’agarose est transférée dans des moules d’enrobage et laissée refroidir légèrement pour éviter d’endommager les tissus.

Le tissu peut ensuite être soigneusement immergé et l’agarose peut durcir. Les blocs résultants sont coupés, puis collés à une platine d’échantillon et sectionnés à l’aide d’un vibratome, qui est un instrument qui utilise une lame vibrante pour couper de fines tranches de tissu vivant. Au fur et à mesure que les tranches sont générées, elles sont soigneusement transférées sur une plaque enduite contenant des milieux de culture et cultivées comme mentionné précédemment.

L’utilisation de cultures d’explants présente un certain nombre d’avantages par rapport aux méthodes in vivo et autres méthodes in vitro. Tout d’abord, les cellules des tissus explantés sont plus accessibles aux outils expérimentaux. Deuxièmement, le fait que les explants maintiennent l’architecture cellulaire complexe du tissu neural en développement signifie que les interactions cellule-cellule peuvent être étudiées. Troisièmement, puisqu’ils peuvent contrôler la composition chimique du milieu de culture, les scientifiques peuvent utiliser des explants pour tester l’effet de composés spécifiques sur le développement des tissus.

Néanmoins, puisqu’il est retiré de son environnement naturel, des précautions particulières doivent être prises pour maintenir des tissus heureux et sains in vitro. Par exemple, la présence de matrice extracellulaire, ou ECM, a un impact significatif sur le comportement cellulaire, c’est pourquoi les protéines ECM purifiées sont souvent utilisées pour enrober les boîtes de culture. Une autre considération importante est la solution dans laquelle les explants sont baignés. Bien que les milieux de culture cellulaire traditionnels soient souvent utilisés, certaines expériences nécessitent des solutions qui ressemblent beaucoup au liquide circulant dans le système nerveux central : le liquide céphalo-rachidien, qui est un réactif essentiel dans des expériences comme celles que vous allez voir.

Maintenant que nous avons passé en revue les méthodes de culture d’explants, voyons comment ces techniques sont utilisées.

Les tests de migration cellulaire utilisent des tissus explantés pour examiner les signaux répulsifs et attractifs impliqués dans le mouvement des cellules neurales. Dans cette expérience, des billes qui ont été préalablement trempées dans des facteurs de croissance sont implantées dans des explants de cerveau postérieur pour examiner la migration des cellules neurales. Après 3 à 4 jours d’exposition, les neurones ont été imagés à l’aide d’un microscope confocal. Les résultats montrent que les motoneurones migrent vers les billes imbibées de facteur de croissance endothélial vasculaire, mais ne contrôlent pas les billes imbibées de tampon.

Les essais de co-culture sont souvent utilisés pour étudier les interactions cellule-cellule au cours du développement. Dans cet exemple, des segments de moelle épinière ont été cultivés sur une couche de cellules musculaires pour étudier comment les connexions sont établies entre les motoneurones de la colonne vertébrale et le muscle squelettique. Dès 2 jours après l’incubation, des projections des neurones, également appelées névrites, émergent de l’explant. En 5 jours, l’innervation fonctionnelle est observée par la contraction de la couche de cellules musculaires.

Au cours du développement du système nerveux, les neurones doivent allonger leurs axones pour établir une connexion entre le tissu cible et le système nerveux central. L’une des façons d’étudier ce processus complexe consiste à utiliser des tests de guidage axonal. Les chercheurs utilisent des tissus explantés pour examiner les facteurs dans les neurones et dans l’environnement environnant qui aident à guider l’axone vers son bon emplacement.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur l’explantation de culture de tissu neural. Cette vidéo présente un aperçu des avantages des cultures d’explants, des stratégies de culture, des protocoles étape par étape de deux procédures d’explants couramment utilisées et de la manière dont ces techniques sont utilisées en laboratoire aujourd’hui.

Merci d’avoir regardé !