JoVE Science Education

Advanced Biology

Culture d'explants de tissu neural

JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Neuroscience

Explant Culture of Neural Tissue

1.12: Neuronal Transfection Methods

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

22,345 Views

•

07:45 min

•

April 30, 2023

Overview

La structure élaborée du système nerveux des vertébrés provient d’une série complexe d’événements impliquant la différenciation cellulaire, la migration cellulaire, et des changements dans la morphologie des cellules. L’étude de ces processus est fondamentale pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux ainsi que notre capacité à diagnostiquer et à traiter les troubles qui résultent d’un développement anormal. Cependant, les tissus nerveux sont relativement inaccessibles pour des manipulations expérimentales, en particulier chez les embryons de mammifères. Par conséquent, de nombreux scientifiques utilisent la culture d’explant pour étudier les processus de développement neurologique dans un environnement “organotypique“, ce qui signifie que le tissu est retiré de l’organisme, mais son architecture cellulaire complexe est maintenue. En général, les cultures d’explants sont créées par dissection minutieuse du tissu neural qui est ensuite immergé dans un milieu de croissance finement élaboré, et mis en culture in vitro.

Cette vidéo commence par une brève vue d’ensemble de la culture des explants de tissu neural, incluant les avantages par rapport à d’autres méthodes in vitro, et des considérations importantes pour le maintien de tissus sains. Ensuite, un protocole général est fourni pour la mise en place de la culture d’explants de cerveau embryonnaire de souris, décrivant l’isolement des embryons de la mère et la dissection du cerveau. La présentation comprend également un aperçu de la culture en coupe, dans lequel de fines sections de tissus du système nerveux sont générées pour un meilleur accès visuel aux cellules en développement. Enfin, quelques utilisations de ces techniques sont fournies afin de démontrer comment elles peuvent être utilisées pour répondre à des questions importantes dans le domaine du neurodéveloppement.

Procedure

La culture d’explant est utilisée comme technique pour étudier le développement de populations cellulaires spécifiques et les structures neurales. Dans les expériences sur le neurodéveloppement, les explants sont des tissus neuraux extraits d’un embryon et cultivés in vitro. Ces cultures donnent au chercheur la possibilité de manipuler et de visualiser les tissus en développement par des moyens qui seraient impossible in vivo. Cette vidéo introduira quelques principes sur lesquels s’appuie le travail avec des tissus explantés, les procédures pas à pas de deux techniques de culture d’explants ainsi que des utilisations de ces techniques.

Avant d’aborder les méthodes, revoyons certains principes de base. Les explants peuvent être issus de différents organismes modèles et d’une variété de types de tissus. En général, les cultures sont créées en retirant délicatement du tissu neural d’un embryon, en disséquant la région d’intérêt, et en la plaçant dans un environnement artificiel. Les tissus peuvent aussi être sectionnés en coupes fines et cultivés en « culture en coupe ». Du fait que l’environnement de culture est supposé imiter les conditions in vivo de l’organe entier, cette technique de culture est souvent appelée « organotypique ».

Avant de commencer, assurez-vous de stériliser vos instruments avec de l’éthanol à 70%. Puis, euthanasiez une souris enceinte en utilisant le protocole préféré de votre labo. Ensuite, excisez chirurgicalement l’utérus et placez le dans un tampon refroidit dans la glace. Transférez la section sur un microscope de dissection et retirez les embryons de leur sac vitellin. Ensuite, isolez le cerveau, disséquez avec précaution votre région d’intérêt, et transférez la dans une boite contenant du milieu de culture. Les explants peuvent être maintenus dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO2 pendant quelques semaines en remplaçant 50% du milieu tous les 2-3 jours.

Les cultures en coupes de tissus du cerveau nécessitent quelques étapes supplémentaires. Avant la coupe, le tissu est enrobé dans de l’agarose, ce qui permet son soutien pour qu’il reste intact pendant la coupe. Pour ce faire, une solution à 1,5% d’agarose à point de fusion bas est chauffée jusqu’à dissolution de l’agarose. L’agarose est ensuite transféré dans des moules d’inclusion et laissé un peu refroidir pour éviter d’endommager le tissu. Le tissu peut ensuite être soigneusement immergé et l’agarose va durcir. Les blocs obtenus sont coupés, collés à un porte-échantillon, et sectionnés grâce à un vibratome, un instrument avec une lame vibrante pour couper de fines sections de tissus vivants. Les coupes obtenues sont soigneusement transférées sur une plaque contenant le milieu de culture et sont cultivées comme indiqué précédemment.

Il y a de nombreux avantages à utiliser la culture d’explants plutôt que les méthodes in vivo et d’autres in vitro. Premièrement, les cellules des tissus explantés sont plus accessibles pour les outils expérimentaux. Deuxièmement, le fait que les explants conservent l’architecture cellulaire complexe du tissu neural en développement signifie que les interactions cellule-cellule peuvent être étudiées. Troisièmement, étant donné que les chercheurs peuvent contrôler la composition chimique du milieu de culture, ils peuvent tester l’effet de composés spécifiques sur le développement du tissu.

Néanmoins, puisque le tissu est séparé de son milieu naturel, une attention particulière doit être portée pour le maintenir heureux et en bon état sous in vitro. Par exemple, la présence de matrice extracellulaire, ou MEC, a un impact significatif sur le comportement cellulaire, donc des protéines purifiées de MEC sont souvent utilisées dans les boîtes de culture. Un autre critère important est la solution dans laquelle les explants sont cultivés. Le milieu de culture cellulaire traditionnel est souvent utilisé, mais certaines expériences requièrent des solutions qui ressemblent de près au fluide circulant dans le système nerveux central: le liquide céphalo-rachidien, qui est un réactif critique dans les expériences comme celles que vous êtes sur le point de voir.

Maintenant que nous avons vu les méthodes de culture d’explants, voyons comment ces techniques sont utilisées.

Les tests de migration cellulaire utilisent les explants pour examiner les signaux répulsifs et attractifs impliqués dans la migration des cellules neurales. Dans cette expérience, des billes préalablement imprégnées de facteurs de croissance sont implantées dans des explants de cerveau postérieur pour étudier la migration des cellules neurales. Après 3 à 4 jours d’exposition, les neurones sont visualisés grâce à un microscope confocal. Les résultats montrent que les neurones moteurs migrent vers les billes imprégnées de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, mais pas vers les billes de contrôle.

Les expériences de co-culture sont souvent utilisées pour étudier les interactions cellule-cellule au cours du développement. Dans cet exemple, des segments de moelle épinière ont été cultivés sur une couche de cellules musculaires pour étudier la façon dont les connexions sont faites entre les neurones moteurs spinaux et les muscles squelettiques. Après 2 jours d’incubation, les projections des neurones, aussi appelées neurites, sortent de l’explant. Dans les 5 jours, une innervation fonctionnelle est mise en évidence par la contraction de la couche de cellules de muscle.

Au cours du développement du système nerveux, les neurones doivent allonger leurs axones pour établir une connexion entre le tissu cible et le système nerveux central. Une manière d’étudier ce processus complexe est par essais de guidage axonal. Les chercheurs utilisent des tissus explantés pour examiner les facteurs dans les neurones et dans le milieu environnant qui aident à guider l’axone à l’emplacement approprié.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur la culture d’explants de tissu neural. Cette vidéo a parcouru les avantages des cultures d’explants, les stratégies de culture, les protocoles pas à pas de deux procédures d’explants souvent utilisées et comment ces techniques sont utilisées en laboratoire aujourd’hui. Merci de nous avoir regardés!

Transcript

Explant cultures serve as a technique to investigate the development of specific cell populations and neural structures. In developmental neuroscience experiments, explants are neural tissues excised from an embryo for continued development in vitro. These cultures give researchers the ability to manipulate and visualize the developing tissues in ways that are not possible in vivo. This video will introduce some important principles behind working with explanted tissues, step-by-step procedures for two approaches to explant culture, as well as applications of this technique.

Before delving into the methods, lets go over some basic principles. Explants can be established from a number of model organisms and a variety of tissue types. Generally, the cultures are created by carefully removing neural tissue from an embryo, dissecting away a region of interest, and placing it into an artificial environment.

Tissues can also be sectioned into thin sheets and grown in “slice culture.” Because the culture environment is designed to mimic the in vivo conditions of the whole organ, this culture strategy is often called “organotypic.”

Before getting started, be sure to sterilize your instruments with 70% ethanol. Next, euthanize a pregnant mouse using your lab’s preferred method. Then, surgically excise the uterus and place in ice-cold buffer. Transfer the dish to a dissection microscope and remove individual embryos from their yolk sac. Next, isolate the brain, carefully dissect out your region of interest, and transfer to a culture dish containing culture medium. Explants can be maintained in a 37 °C incubator containing 5% CO2 for a few weeks by replacing 50% of the medium every 2 – 3 days.

Slice culture of brain tissue requires a few extra steps. Prior to sectioning, the tissue is embedded in agarose, which provides support to the tissue so it remains intact while it’s being sliced. To do this, a 1.5% low melting point agarose solution is heated until the agarose dissolves. Next, the agarose is transferred to embedding molds and allowed to cool slightly to avoid damaging the tissue.

The tissue can then be carefully submerged and the agarose left to harden. The resulting blocks are trimmed and then glued to a specimen stage and sectioned using a vibratome, which is an instrument that uses a vibrating blade to cut thin slices of living tissue. As slices are generated, they are carefully transferred to a coated plate containing culture media and cultured as previously mentioned.

There are a number of advantages to using explant cultures over in vivo and other in vitro methods. First, cells in explanted tissue are more accessible to experimental tools. Second, the fact that explants maintain the complex cellular architecture of developing neural tissue means that cell-cell interactions can be studied. Third, since they can control the chemical composition of the culture medium, scientists can use explants to test the effect of specific compounds on tissue development.

Nevertheless, since it’s being removed from its natural environment, special care must be taken to maintain happy and healthy tissue in vitro. For example, the presence of extracellular matrix, or ECM, has a significant impact on cell behavior, so purified ECM proteins are often used to coat culture dishes. Another important consideration is the solution in which the explants are bathed. While traditional cell culture media is often used, some experiments require solutions that closely resemble the fluid circulating in the central nervous system: the cerebrospinal fluid, which is a critical reagent in experiments like the ones you are about to see.

Now that we have gone over explant culture methods, lets see how these techniques are used.

Cell migration assays use explanted tissue to examine the repulsive and attractive signals that are involved in neural cell movement. In this experiment, beads that have been previously soaked in growth factors are implanted into hindbrain explants to examine neural cell migration. After 3 – 4 days of exposure, neurons were imaged using a confocal microscope. The results show that motor neurons migrate towards beads soaked in vascular endothelial growth factor, but not control beads soaked in buffer.

Co-culture assays are often used to investigate cell-cell interactions during development. In this example, segments of spinal cord were cultured on top of a layer of muscle cells to study how connections are made between spinal motor neurons and skeletal muscle. As early as 2 days after incubation, projections from the neurons, also known as neurites, are seen emerging from the explant. Within 5 days, functional innervation is observed by the contraction of the muscle cell layer.

During development of the nervous system, neurons must elongate their axons to establish a connection between the target tissue and the central nervous system. One way of studying this complex process is through axon guidance assays. Researchers use explanted tissues to examine the factors within the neurons and in the surrounding environment that help guide the axon to its proper location.

You’ve just watched JoVE’s guide to explant culture of neural tissue. This video covered an overview of the advantages of explant cultures, culture strategies, step-by-step protocols of two commonly used explant procedures and ways these techniques are used in the lab today.

Thanks for watching!

Tags

Explant Cultures Development Cell Populations Neural Structures Developmental Neuroscience In Vitro Manipulate Visualize Basic Principles Model Organisms Embryo Artificial Environment Slice Culture Organotypic Culture Sterilize Instruments Pregnant Mouse Surgical Excision