Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones
12 mai 2015
Ce protocole de niveau introductif décrit les réactifs, l’équipement et les techniques nécessaires pour réaliser la coloration immunohistochimique du cerveau des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour la microglie et les éléments neuronaux à titre d’exemple.
L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser l'immunohistochimie afin de visualiser les protéines d'intérêt. Dans cet exemple, IBA1 pour les microglies et pan neuronal pour les neurones. Cela est réalisé en plaçant d'abord des coupes préparées dans une solution de blocage afin d'empêcher la liaison non spécifique.
En guise de deuxième étape, des anticorps reconnaissant les deux protéines d'intérêt différentes sont appliqués sur les coupes et laissés toute la nuit. Ensuite, les coupes sont lavées puis incubées avec des anticorps secondaires afin de marquer les anticorps primaires avec des fluorochromes. Les résultats du double marquage peuvent révéler des colorations des microglies au sein de champs de neurones.
En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront au départ des difficultés, car de nombreuses variables doivent être ajustées. Hazel May, une étudiante de premier cycle dans notre laboratoire, démontrera cette technique aujourd'hui. Commencez par fixer et sectionner soigneusement les cerveaux de rongeurs comme décrit dans le protocole textuel accompagnant, puis conservez-les soigneusement à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.
Lorsque vous êtes prêt à poursuivre le protocole, retirez les lames du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante. Une fois décongelées, placez les lames dans un support et rincez-les trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacun. À partir de ce moment, veillez à ce que les sections ne s'assèchent pas.
Séchez les bords des lames et tracez une frontière hydrophobe autour du bord de la lame à l’aide d’un stylo à papier pour assurer une répartition uniforme du liquide et réduire les effets de bord. Ensuite, bloquez les sections en ajoutant 300 microlitres de sérum dans du PBS sur chaque lame. Le sérum doit provenir de l’espèce dans laquelle l’anticorps secondaire a été produit.
Dans ce cas, un sérum de âne a été utilisé. Veillez à ce que la solution de blocage s'étende jusqu'au bord de la lame et recouvre complètement le tissu. Pour éviter une coloration inégale, placez les lames dans une chambre humide et incubez-les à température ambiante pendant une heure.
Pendant l'incubation, préparez les anticorps primaires en diluant l'anticorps IBA un à 5 000 et l'anticorps pan-neuronal à 1/500 dans un mélange contenant 1 % de sérum de âne. Dans du PBS, retirez la solution de blocage et ajoutez 300 microlitres de la solution d'anticorps, qui contient les deux anticorps d'intérêt. Préparez également trois lames témoins.
Ajouter 300 microlitres du IVA, une dilution seule sur une lame, 300 microlitres de la dilution d'anticorps pan-neuronal seule sur une deuxième lame, et 300 microlitres de sérum de baudet à 1 % dans du PBS. Sur une troisième lame, placer toutes les lames dans une chambre humide et les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune.
Préparez le mélange d'anticorps secondaires fluorescents en diluant chacun d'eux au 1/250 dans du sérum de baudet à 1 % dans du PBS. Ajoutez 300 microlitres du mélange sur chaque lame et placez les lames dans une chambre humide hermétique à la lumière pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune, puis rincez-les finalement dans de l'eau doublement distillée.
Protégez les lames de la lumière pendant le lavage. Dans du PBS, ajoutez quelques gouttes d'un milieu de montage aqueux qui aide à préserver l'intensité du signal fluorescent sur chaque lame. Ensuite, couvrez, posez la lame à couvre-objet et éliminez les bulles d'air résiduelles à l'aide d'un applicateur en coton pour sceller le milieu de montage sur les lames et empêcher le dessèchement des sections.
Recouvrir les bords avec du vernis à ongles. Les lames sont laissées à sécher à plat pendant une heure dans une boîte protégée de la lumière avant d'être stockées dans un récipient étanche à la lumière, enveloppé dans du papier d'aluminium, à quatre degrés centigrades. Une fois le vernis à ongles sec, apporter les lames dans la salle de microscopie pour l'acquisition d'images.
Préparez la pièce en éteignant les lumières du plafond et en bloquant toutes les autres sources de lumière extérieure. Allumez le microscope, la source de lumière fluorescente et l'ordinateur d'imagerie. Ensuite, placez une lame sur la platine du microscope et mettez-la au point.
À l'aide du logiciel fourni, réglez l'exposition pour chaque longueur d'onde séparément. Évitez d'exposer trop longtemps la lame à la lumière afin de prévenir la photodégradation de l'échantillon. Ensuite, acquérez les images dans chaque canal sans déplacer la section ni ajuster la mise au point.
Combinez les images à l'aide du logiciel d'imagerie et enregistrez-les pour une analyse ultérieure. En utilisant le protocole de coloration décrit ci-dessus, des images fluorescentes telles que celles présentées ici peuvent être facilement obtenues : dans le canal rouge, les microglies positives à l'IBA1 apparaissent clairement, et dans le canal vert, les neurones positifs pan-neuronals se distinguent nettement du fond. Les images témoins pour ces deux colorations par anticorps sont présentées.
Le double marquage sombre avec IBA1 et un marqueur pan-neuronal illustré ici démontre principalement des microglies ramifiées, avec de longues projections neuronales fines visibles à travers les couches corticales. Des résultats de coloration comme ceux présentés ici peuvent également survenir si la qualité du tissu est médiocre. Une mauvaise qualité tissulaire se manifeste par l'absence de corps cellulaires bien définis ainsi que par des prolongements microgliaux et neuronaux fragmentés.
Il existe un manque de netteté de la coloration des microglies et une absence totale de coloration neuronale, ce qui rend l'image superposée non significative lors de la tentative de cette technique. Il est important de recouvrir uniformément les sections et de ne pas les laisser sécher entre les étapes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des techniques d'immunohistochimie de base.
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Aperçu
Ce protocole décrit le processus de coloration immunohistochimique pour les cerveaux de rongeurs, en se concentrant sur les microglies et les éléments neuronaux. Il précise les réactifs, l'équipement et les techniques nécessaires pour une visualisation réussie des protéines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunohistochimie
- Biologie cellulaire
Contexte
- L'immunohistochimie est une technique utilisée pour visualiser des protéines spécifiques dans des sections de tissus.
- Les microglies sont les cellules immunitaires principales du cerveau, jouant un rôle crucial dans la neuroinflammation.
- Les neurones sont les unités fondamentales du cerveau, chargées de la transmission de l'information.
- L'étiquetage double permet la visualisation simultanée de différents types cellulaires.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'utilisation de l'immunohistochimie pour visualiser les microglies et les neurones.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs souhaitant étudier le tissu cérébral.
- Approfondir la compréhension des interactions cellulaires dans le cerveau.
Méthodes utilisées
- Préparation de coupes cérébrales et de solution de blocage pour prévenir la liaison non spécifique.
- Application d'anticorps primaires spécifiques aux protéines microgliales et neuronales.
- Incubation des coupes avec des anticorps secondaires afin d'introduire des marqueurs fluorescents.
- Étapes de lavage pour éliminer les anticorps non liés et améliorer la clarté du signal.
Résultats principaux
- Marquage double réussi des microglies et des neurones dans des coupes cérébrales de rongeur.
- Visualisation des interactions microgliales avec les éléments neuronaux.
- Démonstration de l'efficacité du protocole d'immunohistochimie.
- Mise à disposition d'une méthode reproductible pour les études futures.
Conclusions
- Le protocole met efficacement en évidence la présence de microglies et de neurones.
- L'immunohistochimie est un outil précieux pour la recherche en neurosciences.
- Des études supplémentaires peuvent s'appuyer sur cette méthodologie pour explorer la pathologie cérébrale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'immunohistochimie permet une cartographie spatiale précise de l'expression des protéines dans les tissus, soutenant la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments en neurosciences. Le double marquage fluorescent permet l'analyse de la co-localisation des microglies et des neurones, offrant des informations sur les voies neuroinflammatoires et les interactions cellulaires pertinentes pour les thérapeutiques du système nerveux central. Cette méthode renforce la fiabilité prédictive en générant des données d'imagerie reproductibles et quantitatives pour les tests d'hypothèses en phase précoce.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant l'engagement de la cible dans les microglies et les populations neuronales.
- Valeur opérationnelle : Soutient la réduction des risques biologiques par l'observation directe de la localisation protéique dans des tissus cérébraux pertinents pour la maladie.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en confirmant la présence de la cible et son contexte cellulaire avant l'optimisation du composé candidat.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Produit des protocoles de coloration standardisés et reproductibles pour les marqueurs des microglies et des neurones, applicables au criblage de composés.
- Données quantitatives : Génère des données d'intensité de fluorescence permettant de comparer les effets des traitements sur l'expression des cibles.
- Réutilisation de la plateforme : Adaptable à de multiples antigènes, ce qui permet le développement de tests multiplexés pour l'analyse de voies biologiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise les affections neuroinflammatoires en suivant simultanément les états d'activation des microglies et l'intégrité neuronale.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro au contexte tissulaire in vivo, renforçant ainsi l'alignement des biomarqueurs.
- Décisions ajustées au risque : Guide les critères de poursuite ou d'abandon grâce à des preuves histopathologiques de modulation de la cible et d'effets hors cible.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'évaluation préclinique, permettant une amélioration itérative de candidats médicaments pour le SNC fondée sur l'interaction avec la cible au niveau tissulaire.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en révélant les profils de co-localisation de cibles immunomodulatrices avec des marqueurs neuronaux.
- Tri : Fournit des sections de tissus prêtes à l'analyse, avec une qualité de coloration constante, pour le profilage de bibliothèques de composés.
- Analytique : Fournit des signaux de fluorescence quantitatifs permettant la comparaison statistique de l'expression protéique entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes moléculaires aux phénotypes cellulaires dans les tissus cérébraux, facilitant la validation de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole d'immunohistochimie standardisé applicable à plusieurs projets en neurosciences et à différentes classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation de la cible grâce à la détection directe des protéines avec résolution spatiale dans l'architecture tissulaire native.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité par le biais de protocoles standardisés de blocage, de titrage des anticorps et d'imagerie.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans la biologie des cibles du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une avancée ajustée au risque en confirmant l'engagement de la cible dans les types cellulaires pertinents avant des études précliniques coûteuses.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Exige une expertise en fixation des tissus, en sectionnement et en manipulation des anticorps afin de préserver l'intégrité des antigènes.
- Dépend de l'infrastructure de microscopie à fluorescence et d'analyse d'images pour la détection et la quantification du signal.
- Nécessite une standardisation interéquipes des conditions de blocage et des dilutions d'anticorps pour garantir la reproductibilité des résultats entre différents sites.
- Doit tenir compte de variables spécifiques aux tissus, telles que la durée de fixation et l'épaisseur des sections, qui influencent l'uniformité de la coloration.
- Limité par la décroissance du signal de fluorescence dans le temps, ce qui exige un montage et un stockage appropriés pour maintenir l'intégrité des données.
