Name: Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Apprenez l'immunohistochimie sur cerveau de rat cryosectionné pour visualiser microglies et neurones. Ce protocole détaillé permet une double marquage fluorescent reproductible en neurosciences.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier M. Ryan Hart et M. Arriz Lucas pour leurs précieux commentaires sur cette communication. Ce travail a été soutenu par le NIH NINDS R01 NS065052 et les fonds de soutien à la mission de l’hôpital pour enfants de Phoenix.

NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de l&#39;Arizona. Une liste des matériaux et équipements recommandés peut être trouvé dans le tableau 1. 1. Préparation des tissus <ol><li> Perfusion <ol><li> Euthanasier rongeur avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, IP), et perfuser transcardiaque avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) jusqu&#39;à complètement exsangue (3-5 min) à un débit de 8 ml / min. Pour obtenir des instructions de perfusion en profondeur, voir Gage et al 2012 9. </li><li> Immédiatement après PBS chasse d&#39;eau, réparer les tissus par perfusion avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15-20 min à un débit de 8 ml / min de débit. </li><li> Retirer le cerveau et dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, suivie de solutions de saccharose graduées (15%, 30%, 30%, en séquence, préparé dans une solution saline tamponnée tris) à 4 ° C. Transférer le cerveau postérieur à la solution de saccharose oeuls après que le cerveau a sombré dans chaque solution. Note: Habituellement, 5 jours dans chaque solution est suffisamment de temps pour les tissus de couler. </li></ol></li><li> La congélation de tissus et Cryosectioning <ol><li> Placez le cerveau en milieu d&#39;inclusion, tel que le composé PTOM et plonger dans l&#39;isopentane à une température de -35 ° C. Laisser le cerveau de geler pendant un minimum de 10 min, puis stocker à -80 ° C. Des problèmes peuvent survenir si la diligence à la température ne sont pas prises; s&#39;il vous plaît voir la discussion des informations de dépannage. </li><li> Couper coupes sériées coronales d&#39;une épaisseur de 20 um et une température de -20 ° C. Prélever des tissus sur des lames chargées positivement. coupes de cerveau peuvent être placés dans une boîte de diapositives enveloppé dans une feuille dans un sac zip-top et à long terme conservés à -80 ° C. Cette méthode de stockage crée une double frontière pour prévenir l&#39;exposition à l&#39;air et au gel. </li></ol></li></ol> 2. Traitement des tissus NOTE: Exemple équipements et matériaux rbligatoire pour la coloration sont présentés dans la figure 3. Des alternatives sont disponibles, cependant, ces images vont aider les nouveaux à la coloration immunohistochimique de visualiser les éléments appropriés avant d&#39;acheter. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figure 3: Exemple éléments nécessaires pour la coloration immunohistochimique La boîte noire montré en (A) est une chambre d&#39;humidité idéal pour immunofluorescence, sous forme de diapositives sont protégés de la lumière sans la nécessité d&#39;envelopper la boîte sur une feuille.. Après sectionnement, diapositives peuvent être stockés dans une boîte comme la boîte jaune montré en (B). Envelopper la boîte hermétiquement dans du papier et placer dans un sac zip-top avant la congélation permet de protéger les échantillons de tissus de brûlures de congélation. Un exemple de lames est donnée en (C), avec des plats différents de coloration décrits dans (D) et (E </strong&gt;). Lamelles peuvent varier en taille et en épaisseur (F), cependant 1.2 lamelles épaisses fournissent des résultats d&#39;imagerie de belles sur la plupart des microscopes droits et confocale. Un crayon telle que celle représentée dans (G) peut être utilisé pour marquer les diapositives. Marqueurs permanents doivent être évités car l&#39;encre peut fonctionner, affectant à la fois la coloration et la capacité de déterminer ce que l&#39;échantillon est. Un mini stylo pap tel que représenté dans (H) permet une frontière imperméable à tirer sur des lames. <ol><li> Préparation de lames <ol><li> Retirer les lames du congélateur et décongeler à température ambiante. <ol><li> Facultatif: Si sections ont déjà flotté à partir de diapositives, placez diapositives décongelés dans un four à 60 ° C pendant plus de 4 heures pour aider à prévenir des coupes de tissus de flotter hors diapositives. </li></ol></li><li> Placer les lames dans un rack de diapositives et plat correspondant. </li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. De ce pas en avant, éviter d&#39;avoir sections sans liquide pendant de longues périodes de temps. Note: Si les sections se dessèchent, la coloration de fond est augmentée et des données significatives ne peut pas être obtenue de manière fiable. </li></ol></li><li> La coloration des tissus <ol><li> Dans une boîte de coloration étanche à la lumière, de créer une «chambre d&#39;humidité&quot; avec des tissus non pelucheux trempé avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Sécher les bords de la lame avec un tissu non pelucheux, utiliser un mini stylo pap à faire une bordure de répulsif des liquides à l&#39;orée de la diapositive, loin des coupes de tissus. Cette frontière devrait garantir suffisamment d&#39;espace entre la surface du bain de liquide et le bord du tissu de telle sorte que la tension de surface ne modifie pas la coloration. NOTE: Le répulsif frontière stylo pap peut être appliqué avant la 2.1.3 si les anticorps d&#39;intérêt ne nécessitent pas de micro-ondes récupération d&#39;antigène. Si la plume de Pap a été appliquée avant le lavage en PBS, l&#39;intégrité de la frontière imperméable au liquide doit être vérifiée à ce stade. Utilisez un stylo mini-pap pour combler les lacunes dans la frontière. </li><li&gt; Avec glissières fixées horizontalement, la liaison bloc antigène non spécifique par incubation à 4% v / v de sérum dans du PBS (solution de blocage). Pipette 300 pi de solution de bloc par diapositive pendant 1 heure à température ambiante. Assurez-vous que la solution de bloc étend à la plume de Pap au bord de la diapositive et recouvre complètement le tissu pour éviter les taches inégale causée par la tension de surface à proximité du tissu. <ol><li> Utilisation sérum de la même espèce dans laquelle l&#39;anticorps secondaire est effectué. Remarque: Dans cette procédure, les anticorps secondaires sont fabriqués en âne, et donc sérum âne est utilisé. Si des anticorps secondaires à partir de deux ou plusieurs espèces différentes sont utilisées, y compris le sérum de chaque espèce. </li></ol></li><li> Pipette anticorps primaire sur des lames. Remarque: Les concentrations d&#39;anticorps pour cette coloration ont été optimisés au 1: 5000 et 1: 500 pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Ces concentrations ont été trouvées pour montrer coloration significative avec une absence de coloration de fond. <ol><li> Diluer la solution de bloc1% de sérum dans du PBS et ajouter des anticorps primaires. Pipeter 300 ul de solution d&#39;anticorps primaire dans 1% de sérum par lame. Encore une fois, d&#39;assurer le fluide est au bord de la plume de Papanicolaou. Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Inclure trois lames de contrôle: l&#39;une qui contient des anticorps ni Iba1 ni Pan-neuronales, une avec Iba1 sans anticorps pan-neuronal, et l&#39;un avec l&#39;anticorps pan-neuronal sans Iba1. Colorer ces diapositives dans la même série avec les mêmes solutions, cependant omettre les anticorps primaires pour tester la liaison non spécifique des anticorps secondaires. </li></ol></li><li> Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. </li><li> Anticorps fluorescents sont sensibles à la lumière, donc, de ce pas en avant, de minimiser l&#39;exposition de lumière en veillant à conteneurs de lavage sont enveloppés dans des feuilles et d&#39;hybridation boîtes sont soit noir ou incubées dans l&#39;obscurité. Introduire à la pipette les anticorps secondaires appropriés sur toutes les diapositives et incuber60 min à température ambiante à une concentration de 1: 250 dans une solution de bloc (voir l&#39;étape 2.2.3) dans une &quot;chambre d&#39;humidité&quot; étanche à la lumière (voir l&#39;étape 2.2.1). <ol><li> Utilisez Anticorps secondaires de différentes longueurs d&#39;onde. Ici, pour le lapin d&#39;anticorps primaire anti-Iba1, utiliser âne de lapin anti-594 comme anticorps secondaire approprié. Pour la souris de l&#39;anticorps primaire anti-pan-neuronal, utiliser âne anti-souris 488 comme anticorps secondaire approprié. Alternativement, utiliser anti-lapin 488 et 594 anti-souris. </li></ol></li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun. </li><li> Facultatif: effectuer une coloration nucléaire. <ol><li> Place à Hoechst (ou autre colorant nucléaire) à une concentration de 0,03 pg / ml dans le double H 2 0 distillée pendant exactement 60 secondes. </li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun. </li></ol></li><li> Laver à ddH 2 0. </li></ol></li><li> Lamelles <ol><li> Lames couvre-objet avec un milieu de montage aqueux, tels que Fluoromount-G ou ProlongGold. Prendre soin d&#39;enlever toutes les bulles à l&#39;aide d&#39;un coton-tige. Note: D&#39;autres agents de montage pourraient être utilisés, si haut purge à travers entre les colorants a été noté par certains au sein de jours de lamelles. </li><li> Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller les bords, ce qui empêche les sections du dessèchement dû à l&#39;évaporation. Laisser sécher le vernis à ongles dans un récipient étanche à la lumière tout en diapositives restent à plat et à la température ambiante, puis stocker dans un récipient étanche à la lumière enveloppé dans une feuille à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Imagerie Tissue Stained <ol><li> Microscopie <ol><li> Laisser le vernis à ongles à sécher pendant au moins une heure avant le début de la microscopie, qui devrait avoir lieu dans une pièce sombre. </li><li> Acquérir photomicrographies utilisant un microscope confocal ou d&#39;un microscope de recherche avec une source de lumière fluorescente et un module appareil photo numérique. Utilisation du logiciel d&#39;accompagnement, régler l&#39;exposition pour chaque longueur d&#39;onde - 405, 488, et 594 - séparément. Remarque: en profondeur des instructions d&#39;imagerie devraient être disponibles en ligne à partir du fabricant de microscope. </li><li> Acquérir photomicrographies dans chaque canal sans déplacer les sections ou d&#39;ajuster la mise au point. Prendre des images en couleur, en niveaux de gris ou en alternance et de les convertir à la couleur par la suite. Remarque: couleur ou en niveaux de gris de chaque canal peuvent être rassemblés dans le post-traitement. </li><li> Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas exposés à la lumière ambiante ou la lumière microscopique pendant de longues périodes de temps, comme photo-blanchiment des sections aura lieu. Pour éviter cela, augmenter le temps d&#39;exposition plutôt que d&#39;augmenter l&#39;intensité lumineuse / laser. </li><li> Ne coupez pas la source de lumière fluorescente dans les 30 minutes d&#39;être allumé. Note: Changement de la source sur et en dehors en succession rapide peut diminuer la durée de vie de l&#39;ampoule fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;objectif global de cette communication était d&#39;introduire des procédures d&#39;immunohistochimie pour le lecteur. Pour cela, l&#39;exemple de double marquage avec Iba1 et antigènes Pan-neuronales pour observer les microglies et les neurones dans paraformaldéhyde perfusé, le saccharose cerveau cryoprotégés, rat cryosectioned a été utilisé. Cette technique peut être adaptée pour servir des fins interminables. Un tableau d&#39;antigènes différents dans une variété de types tels que, m...

<html> L&#39;immunohistochimie est un procédé pour la détection d&#39;antigènes (par exemple des protéines) dans des coupes de tissu en utilisant des anticorps primaires qui se lient spécifiquement à des antigènes d&#39;intérêt. L&#39;immunohistochimie a été lancée par JR Marrack en 1934 quand il a déterminé que les anticorps peuvent localiser des antigènes avec une grande spécificité 1. A partir de 1942, une partie de la première des études in vitro utilisant des anticorps fluorescents pour visualiser immunohistochimie ont été publiés 2,3, après quoi la première étude in vivo histochimique a été publié 4. Au cours des années 1960, trois ans après le début de méthodes immunohistochimiques, des anticorps conjugués enzymatiques ont commencé à être utilisés comme réactifs secondaires. Ces méthodes ont été développées simultanément et indépendamment en France et aux Etats-Unis 5,6. Aujourd&#39;hui, un large éventail d&#39;anticorps offre des possibilités infinies pour les études d&#39;immunohistochimie 7. &quot;&gt; L&#39;objectif global de cette correspondance est de fournir une brève introduction dans la coloration immunohistochimique; il est pas censé être un examen complet et exhaustif de cette technique dans le procédé décrit, des techniques d&#39;immunohistochimie pour deux antigènes sont présentés (marqueurs de la microglie et. neurones) pour la coloration de paraformaldehyde perfusé, le saccharose cryoprotégés, le cerveau de rat cryosectioned. La coloration immunohistochimique commence par bloquer la liaison pour réduire la coloration de fond antigène non spécifique. Ensuite, l&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire permet de se lier à un antigène spécifique dans le tissu. À la suite de l&#39;anticorps primaire, un autre anticorps, appelé anticorps secondaire, est appliquée pour lier l&#39;anticorps primaire à un signal de visualisation conjugué 8. L&#39;anticorps secondaire cible de l&#39;immunoglobuline G (IgG) domaine spécifique de l&#39;espèce dans laquelle l&#39;anticorps primaire a été soulevée. L&#39;anticorps secondaire amplifie le signal de l&#39;anticorps primaire depuis les régions Fab de til anticorps secondaire se lient à des sites multiples sur le domaine IgG de l&#39;anticorps primaire. Chacune des enzymes ou des molécules fluorescentes conjuguées aux régions F c de l&#39;anticorps secondaire permettent la visualisation. Par exemple, un anticorps primaire anti-lapin Iba1 est une molécule d&#39;IgG de lapin spécifique pour Iba1. Lorsque âne anti-IgG de lapin est appliqué comme un anticorps secondaire, on reconnaître et se lier à de multiples régions de l&#39;anticorps de lapin anti-IgG Iba1 (voir figure 1). L&#39;anticorps peut être visualisé âne par divers procédés. Cette correspondance met l&#39;accent sur la détection d&#39;un fluorophore conjugué à l&#39;anticorps secondaire qui reconnaît l&#39;anticorps primaire, pour la visualisation par microscopie fluorescente. En immunohistochimie fluorescent, un colorant nucléaire Hoechst ou comme DAPI peut être utilisée pour visualiser tous les noyaux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figure 1: Schreprésentation hématique des vs. directe des techniques de marquage d&#39;anticorps indirecte. anticorps se lient à l&#39;antigène d&#39;intérêt et peut être amplifié par des anticorps secondaires dirigés contre les espèces des anticorps primaires. Cette technique peut être effectuée en utilisant le complexe avidine-biotine (ABC) pour l&#39;amplification et pour la visualisation DAB (A), ou un anticorps secondaire fluorescent directement conjugué (B). Alternativement, des anticorps primaires peuvent être directement conjugués avec de nombreuses balises différentes, y compris la biotine ou un fluorophore (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Une méthode alternative pour la visualisation de la coloration immunohistochimique utilise le 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB; voir les figures 1 et 2). Cela diffère de la fluorescence en utilisant un ou biotinyléla peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire, qui fournit une enzyme pour convertir DAB à un précipité qui est visible en microscopie à fond clair. Dans les cas où un seul antigène est d&#39;intérêt ou de coloration est appelé à être de longue durée, DAB peut être plus approprié de coloration fluorescente. Cependant, DAB coloration est pas bien adapté pour la différenciation entre des marqueurs multiples, en particulier si deux antigènes nucléaires présentent un intérêt. Pour plus d&#39;informations sur les matériaux de DAB et les modifications de protocole, consulter le tableau 1. En variante, un groupe nitro bleu de chlorure de tétrazolium / 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) peut être utilisée pour visualiser une phosphatase alcaline (AP) conjugué secondaire anticorps. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Des images représentatives de sections individuelles marqué DAB nickel améliorée rat tissus du cerveau de rat cerveau tilisezctions qui sont étiquetés avec des DAB de nickel-amélioré pour Iba1 (A) et Pan-neuronale (B) permettre une analyse de longue durée de la microglie ou neurones seul. Barre d&#39;échelle 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Il faut considérer l&#39;abondance estimée de l&#39;antigène d&#39;intérêt dans le tissu analysé. Les méthodes indirectes (comme décrit ci-dessus) sont utiles pour cibles avec une faible abondance. Lorsque l&#39;antigène d&#39;intérêt est en grande abondance, méthodes directes peuvent être appliquées. Les méthodes directes impliquent un anticorps primaire qui est directement conjugué à un signal de visualisation, et donc pas d&#39;anticorps secondaire est exigée. Cette méthode simplifie le processus de coloration, mais élimine l&#39;amplification réalisée par des méthodes indirectes. Utilisation d&#39;un anticorps primaire conjugué directement élimine également la réactivité croisée des anticorps secondaireslors d&#39;un double étiquetage. Cette communication détaille le protocole pour double marquage avec Iba1 et Pan-neuronales (détails dans le tableau 1). Iba1 colore la microglie dans de nombreux états d&#39;activation, notamment ramifiée, hyper-ramifié, activé, amoeboid, et la tige. Taches Pan-neuronales neuronale axones, dendrites, et Soma. Depuis Iba1 taches les plus microglie et les objectifs pan-neuronales le neurone, cette combinaison de taches est utile à acquérir une large compréhension des interactions neurone-microglie. En somme, la coloration immunohistochimique repose sur la sélection rigoureuse des anticorps. Comme la question de la recherche devient plus spécifique, des anticorps dirigés contre les antigènes de rechange peuvent être souhaités. Pour cibler un état d&#39;activation de la microglie spécifique, on peut choisir d&#39;utiliser CD45 ou CD68, plutôt que Iba1. En outre, en travaillant avec des souris, F4 / 80 peut fournir les résultats nécessaires. De même, les éléments neuronaux peuvent être spécifiquement ciblées avec des anticorps raised contre le noyau, synapse (avant ou après), axone, et le cône de croissance. En outre, il ya d&#39;autres marqueurs qui différencient l&#39;âge du neurone (Double-Cortin, NeuN), et la régénération neuronale (GAP-43).

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Diapositives en verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Utilisé pour le montage de tissus (1.2.2)</td></tr><tr><td>Four</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Utilisé pour le séchage de tissus (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Utilisé à l’étape 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slide Stalling Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Utilisé pour tous les lavages pendant la coloration (2.2), ainsi que l’étape Hoechst (2.2.8)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Utilisé pour le séchage des lames (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Utilisé pour les étapes de blocage et de coloration (2.2)</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Utilisé pour l’incubation en bloc et en anticorps (2.2)</td></tr><tr><td>Souris &alpha ;-Pan-neuronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Utilisé pour l’anticorps primaire (2.2.4)</td></tr><tr><td>Lapin &alpha ;-IBA1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Utilisé pour l’anticorps primaire (2.2.4)</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-lapin 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Utilisé pour l’anticorps secondaire (2.2.6)</td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-souris 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Utilisé pour l’anticorps secondaire (2.2.6)</td></tr><tr><td>Feuille du traiteur</td><td>Tout</td><td>N/A</td><td>Utilisé dans les étapes 1.2.2 et 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Utilisé pour le recouvrement (2.2.8)</td></tr><tr><td>Couvre-objectifs</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Utilisé pour le recouvrement (2.2.8)</td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent.</td><td>N’importe lequel</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour la lamelle (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 et LSM 710 (balayage laser, confocal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour l’imagerie (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour l’imagerie (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv ;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>Kit DAB Peroxydase</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>IgG de cheval et alpha ;-lapin biotinylés</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>IgG de cheval et de souris biotinylés</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>30 % Peroxyde d’hydrogène</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>Supports à lames et boîtes de coloration Wheaton</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>Pour le protocole DAB</td></tr><tr><td>Pompe et tube de perfusion Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Utilisé pour la perfusion (1.1.1 et 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek Composé CRYO-OCT (cas de 12)</td><td>Fisher Scientifique</td><td>14-373-65</td><td>Utilisé pour la congélation des tissus (1.2.1)</td></tr><tr><td>Thermomètre (-50 à 50 °C)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Utilisé pour la congélation de tissus (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>CM3500S</td><td>Utilisé pour la coupe de tissus (1.2.2)</td></tr><tr><td>Plat de coloration, plastique avec 2 couvercles</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>Pour le refoulement</td></tr><tr><td>d’antigène Support de coloration à 20 places, lames horizontales</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>Pour le refoulement d’antigène</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>N’importe quel</td><td>N/A</td><td>Pour refoulement d’antigène</td></tr></tbody></table>

primaire pour immunohistochimie sur tissus cryosectioned cerveau de rat: exemple coloration pour microglies et les neurones

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochimie est une technique largement utilisée pour détecter la présence, l&#39;emplacement et l&#39;abondance relative des antigènes in situ. Ce protocole de niveau d&#39;introduction décrit les réactifs, le matériel et les techniques nécessaires pour compléter la coloration immunohistochimique du tissu cérébral des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour les microglies et les éléments neuronaux comme un exemple. Plus précisément, ce document est un protocole étape par étape pour la visualisation fluorescente des microglies et les neurones via immunohistochimie pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Fluorescence double marquage est particulièrement utile pour la localisation de multiples protéines dans le même échantillon, en fournissant la possibilité d&#39;observer avec précision les interactions entre les types de cellules, des récepteurs, des ligands, et / ou de la matrice extracellulaire par rapport à l&#39;autre ainsi que des protéines co- localisation à l&#39;intérieur d&#39;une seule cellule. Contrairement à d&#39;autres techniques de visualisation, la fluorescence immunohistochimie intensité de la coloration peut diminuer enles semaines ou mois suivants coloration, à moins que des précautions appropriées soient prises. Malgré cette limitation, dans de nombreuses applications fluorescence double marquage est préférée à d&#39;autres solutions telles que la 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) ou la phosphatase alcaline (AP), en tant que fluorescence est plus efficace du temps et permet la différenciation plus précise entre deux ou plusieurs marqueurs. La discussion inclut des trucs et conseils pour favoriser la réussite de dépannage.

Ce protocole de coloration résultats dans des coupes de tissus de cerveau de rat qui ont microglie marquées par fluorescence dans le canal 594 (rouge) et neurones marqués dans le canal 488 (vert; voir la figure 4). Si un colorant nucléaire a été fait, il apparaîtra dans le canal 405 (bleu). Les images peuvent être prises dans les différents canaux et superposées pour une comparaison directe des trois canaux, ou entre deux chaînes. De nombreuses suites logicielles d&#39;acquisition numériques incluent ce...

Ce protocole de niveau introductif décrit les réactifs, l’équipement et les techniques nécessaires pour réaliser la coloration immunohistochimique du cerveau des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour la microglie et les éléments neuronaux à titre d’exemple.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser l'immunohistochimie afin de visualiser les protéines d'intérêt. Dans cet exemple, IBA1 pour les microglies et pan neuronal pour les neurones. Cela est réalisé en plaçant d'abord des coupes préparées dans une solution de blocage afin d'empêcher la liaison non spécifique.En guise de deuxième étape, des anticorps reconnaissant les deux protéines d'intérêt différentes sont appliqués sur les coupes et laissés toute la nuit. Ensuite, les coupes sont lavées puis incubées avec des anticorps secondaires afin de marquer les anticorps primaires avec des fluorochromes. Les résultats du double marquage peuvent révéler des colorations des microglies au sein de champs de neurones.En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront au départ des difficultés, car de nombreuses variables doivent être ajustées. Hazel May, une étudiante de premier cycle dans notre laboratoire, démontrera cette technique aujourd'hui. Commencez par fixer et sectionner soigneusement les cerveaux de rongeurs comme décrit dans le protocole textuel accompagnant, puis conservez-les soigneusement à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.Lorsque vous êtes prêt à poursuivre le protocole, retirez les lames du congélateur et laissez-les décongeler à température ambiante. Une fois décongelées, placez les lames dans un support et rincez-les trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacun. À partir de ce moment, veillez à ce que les sections ne s'assèchent pas.Séchez les bords des lames et tracez une frontière hydrophobe autour du bord de la lame à l’aide d’un stylo à papier pour assurer une répartition uniforme du liquide et réduire les effets de bord. Ensuite, bloquez les sections en ajoutant 300 microlitres de sérum dans du PBS sur chaque lame. Le sérum doit provenir de l’espèce dans laquelle l’anticorps secondaire a été produit.Dans ce cas, un sérum de âne a été utilisé. Veillez à ce que la solution de blocage s'étende jusqu'au bord de la lame et recouvre complètement le tissu. Pour éviter une coloration inégale, placez les lames dans une chambre humide et incubez-les à température ambiante pendant une heure.Pendant l'incubation, préparez les anticorps primaires en diluant l'anticorps IBA un à 5 000 et l'anticorps pan-neuronal à 1/500 dans un mélange contenant 1 % de sérum de âne. Dans du PBS, retirez la solution de blocage et ajoutez 300 microlitres de la solution d'anticorps, qui contient les deux anticorps d'intérêt. Préparez également trois lames témoins.Ajouter 300 microlitres du IVA, une dilution seule sur une lame, 300 microlitres de la dilution d'anticorps pan-neuronal seule sur une deuxième lame, et 300 microlitres de sérum de baudet à 1 % dans du PBS. Sur une troisième lame, placer toutes les lames dans une chambre humide et les incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune.Préparez le mélange d'anticorps secondaires fluorescents en diluant chacun d'eux au 1/250 dans du sérum de baudet à 1 % dans du PBS. Ajoutez 300 microlitres du mélange sur chaque lame et placez les lames dans une chambre humide hermétique à la lumière pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune, puis rincez-les finalement dans de l'eau doublement distillée.Protégez les lames de la lumière pendant le lavage. Dans du PBS, ajoutez quelques gouttes d'un milieu de montage aqueux qui aide à préserver l'intensité du signal fluorescent sur chaque lame. Ensuite, couvrez, posez la lame à couvre-objet et éliminez les bulles d'air résiduelles à l'aide d'un applicateur en coton pour sceller le milieu de montage sur les lames et empêcher le dessèchement des sections.Recouvrir les bords avec du vernis à ongles. Les lames sont laissées à sécher à plat pendant une heure dans une boîte protégée de la lumière avant d'être stockées dans un récipient étanche à la lumière, enveloppé dans du papier d'aluminium, à quatre degrés centigrades. Une fois le vernis à ongles sec, apporter les lames dans la salle de microscopie pour l'acquisition d'images.Préparez la pièce en éteignant les lumières du plafond et en bloquant toutes les autres sources de lumière extérieure. Allumez le microscope, la source de lumière fluorescente et l'ordinateur d'imagerie. Ensuite, placez une lame sur la platine du microscope et mettez-la au point.À l'aide du logiciel fourni, réglez l'exposition pour chaque longueur d'onde séparément. Évitez d'exposer trop longtemps la lame à la lumière afin de prévenir la photodégradation de l'échantillon. Ensuite, acquérez les images dans chaque canal sans déplacer la section ni ajuster la mise au point.Combinez les images à l'aide du logiciel d'imagerie et enregistrez-les pour une analyse ultérieure. En utilisant le protocole de coloration décrit ci-dessus, des images fluorescentes telles que celles présentées ici peuvent être facilement obtenues : dans le canal rouge, les microglies positives à l'IBA1 apparaissent clairement, et dans le canal vert, les neurones positifs pan-neuronals se distinguent nettement du fond. Les images témoins pour ces deux colorations par anticorps sont présentées.Le double marquage sombre avec IBA1 et un marqueur pan-neuronal illustré ici démontre principalement des microglies ramifiées, avec de longues projections neuronales fines visibles à travers les couches corticales. Des résultats de coloration comme ceux présentés ici peuvent également survenir si la qualité du tissu est médiocre. Une mauvaise qualité tissulaire se manifeste par l'absence de corps cellulaires bien définis ainsi que par des prolongements microgliaux et neuronaux fragmentés.Il existe un manque de netteté de la coloration des microglies et une absence totale de coloration neuronale, ce qui rend l'image superposée non significative lors de la tentative de cette technique. Il est important de recouvrir uniformément les sections et de ne pas les laisser sécher entre les étapes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des techniques d'immunohistochimie de base.

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo démontre le processus de visualisation d’un interneurone rempli de biocytine dans une coupe d’hippocampe de rat, mettant en évidence son identité neurochimique grâce à l’utilisation d’anticorps spécifiques et de la microscopie à fluorescence.

Immunocoloration des interneurones dans une coupe d’hippocampe de rat

Cette vidéo montre la procédure d’immunomarquage d’une section de tissu cérébral de souris fixe avec des astrocytes marqués par fluorescence à l’aide d’anticorps primaires et secondaires et capture les images des astrocytes colorés par microscopie confocale.

Immunomarquage d’astrocytes marqués par fluorescence dans une coupe de tissu cérébral de souris

Source : Evilsizor, M. N., et. al., Amorce pour l’immunohistochimie sur le tissu cérébral de rat cryosectionné : exemple de coloration pour la microglie et les neurones. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo présente une procédure de coloration immunohistochimique étape par étape sur du tissu cérébral de rat cryosectionné pour visualiser la disposition spatiale de la microglie et des neurones.

Coloration immunohistochimique de cryosections de tissus coronaux de rat pour la microglie et les neurones

Nous présentons ici un protocole optimisé et détaillé pour la double immunocoloration dans des coupes de tissu du système nerveux central (SNC) et des ganglions lymphatiques périphériques (LN) de rat fixées au formol et intégrées en paraffine.

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Ici, nous présentons un protocole qui utilise des colorants quasi-infrarouges en conjonction avec l’immunohistochimie et la numérisation à haute résolution pour les protéines de dosage dans les régions du cerveau.

Utilisation de la fluorescence proche infrarouge et de la numérisation haute résolution pour mesurer l’expression des protéines dans le cerveau des rongeurs

Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d'IBA1 et de TMEM119, en plus de l'analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l'infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Ce protocole décrit une approche efficace et reproductible pour les études histologiques du cerveau de souris, y compris la perfusion, la section du cerveau, l’immunocoloration flottante, le montage tissulaire et l’imagerie.

Immunocoloration flottante libre du cerveau des souris

Les modèles in vivo chez le rat sont des outils indispensables pour étudier les mécanismes pathologiques et les cibles thérapeutiques de l’AVC ischémique. Ce travail décrira la réalisation d’une coloration par immunofluorescence dans des coupes de cerveau infarctus après une occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) chez le rat.

Évaluation de la signalisation de la mort cellulaire par immunofluorescence dans un modèle d’AVC ischémique chez le rat

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial...

Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Apprenez l'immunohistochimie sur cerveau de rat cryosectionné pour visualiser microglies et neurones. Ce protocole détaillé permet une double marquage fluorescent reproductible en neurosciences.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Explorer plus de vidéos