Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

L’objectif global de cette procédure est de faire pousser des ovaires néonatals et/ou des follicules ovariens individuels in vitro. Ceci est accompli en disséquant d’abord les ovaires des femelles froides de l’âge approprié. La deuxième étape consiste à préparer le tissu, y compris la dissection fine des follicules ovariens individuels avec des aiguilles d’acupuncture.

Ensuite, les ovaires néonatals ou les follicules pré-antraux individuels sont cultivés avec une alimentation régulière, et la dernière étape consiste à fixer ou à congeler le tissu pour une analyse histologique ou moléculaire. En fin de compte, le système de culture soutient le développement d’une manière hautement physiologique et peut être utilisé pour examiner la régulation du développement des follicules ovariens et pour étudier les interactions entre les follicules ovariens primordiaux et en croissance. Le principal avantage de cette technique est que les follicules ovariens intacts sont soutenus par le développement des follicules, en maintenant leur structure tridimensionnelle sans avoir besoin de matrices de support.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie ovarienne, et aussi à étudier les effets de composés toxiques tels que la chimiothérapie, les médicaments sur l’ovaire et donc la fertilité féminine. Nous avons d’abord eu l’idée de co-cultiver différents âges et donc stades des follicules ovariens lors de la discussion sur la façon d’étudier les effets des follicules en croissance sur le pool de follicules primordiaux au repos, Vivian Allison, une technicienne du laboratoire et Allison Murray, qui a été scientifique postdoctorale dans le laboratoire pendant de nombreuses années. Tous deux ont contribué à développer des aspects clés de la technique de tirage des pipettes pour ce protocole.

Chauffez et pliez les pipettes en verre au-dessus d’une flamme et faites une coupe nette à l’aide d’un coupe-verre. Ensuite, stérilisez le verre incurvé à 160 degrés Celsius pendant environ 45 minutes. Il faut de la pratique pour obtenir la bonne courbe dans la pipette pour votre technique.

Coupez toujours la pipette avec un coupe-verre afin qu’il n’y ait pas de verre déchiqueté. Vous voulez également vous assurer que vous avez le bon diamètre pour votre tissu Construit pour stériliser le milieu de dissection en milieu lebowitz L 15 avec BSA à travers un filtre de 0,2 micron. C’est 25 millimètres de diamètre construit pour stériliser la culture d’ovaire néonatale.

Passez à travers un autre filtre de 0,2 micron de seulement 25 millimètres de diamètre et recueillez-le dans un tube stérile. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu néonatal à chaque puits d’un 24. Plaquez et transférez une membrane sur la surface du milieu dans chaque puits.

Le milieu de culture folliculaire est également stérilisé par filtre comme le milieu de culture des ovaires. Ensuite, l’huile de silicone doit également être stérilisée par filtre. Ensuite, réparez les plaques de culture de 96 puits avec 30 gouttes d’un microlitre du milieu folliculaire le long de la rangée supérieure.

Recouvrir soigneusement ces puits de 70 microlitres d’huile de silicone. Alternativement, la co-culture de follicules follicules nécessite 100 microlitres de milieu avec une superposition de 100 microlitres d’huile de silicium. Préparez ensuite des plaques de co-culture d’ovaires folliculaires avec un millilitre de milieu par puits et une membrane nucléaire stérilisée aux UV très soigneusement placée.

Commencez par transférer un millilitre de milieu de dissection dans chaque boîte d’embryons en verre stérile. Après avoir coloré les chiots âgés de zéro à cinq jours postnatals, saisissez la peau recouvrant la paroi abdominale avec de fines pinces et inci la peau et la paroi du corps. Ouvrez cette grande incision exposant l’abdomen.

La vessie est généralement engorgée à ce stade et peut être perforée pour faciliter la dissection. À l’aide d’une pince d’horloger, écartez les tripes. Ensuite, de chaque côté, suivez les cornes utérines de la vessie jusqu’au rein.

L’ovaire est une structure en forme de nuage située juste en dessous du rein, au sommet de l’utérus. Saisissez l’ovaire doucement et à l’aide de ciseaux. Coupez-le de l’utérus.

Après avoir disséqué les deux ovaires, transférez-les dans des boîtes remplies de dissection chaude. Douleur moyenne. Utilisez un microscope de dissection avec une platine chauffée à 37 degrés Celsius pour disséquer les ovaires à l’aide d’aiguilles à insuline. Coupez le sac basal et tout excès de matière, y compris la trompe de Fallope, jusqu’à ce qu’il ne reste que l’ovaire.

Transférez ensuite chaque ovaire dans le puits d’une assiette préparée à l’aide d’une pipette incurvée. Placez un ovaire sur chaque culture membranaire, le tissu changeant la moitié du milieu tous les deux jours jusqu’à six jours jusqu’à six jours lorsque vous changez de milieu, placez la pointe de la pipette au bord du puits de milieu pour éviter de perturber la membrane. Après la culture, les ovaires peuvent être conservés congelés ou fixés en histologie ou en immunochimie.

Après avoir recueilli les ovaires de souris plus âgées dans un plat de milieu de dissection chaud, retirez la basa ovarienne. Utilisez des aiguilles à insuline pour couper le sac basal et tout excès de matière, y compris la trompe de Fallope, jusqu’à ce qu’il ne reste que l’ovaire. Ensuite, coupez les ovaires en deux à l’aide des aiguilles et transférez soigneusement chaque moitié dans un verre de montre individuel contenant un millilitre de milieu de dissection.

Couvrez les verres de la montre avec une lame de verre et conservez-les au four jusqu’à une heure dès que possible. En travaillant sous un microscope avec une platine chauffée dans une hotte à flux de lames, disséquez les ovaires en gros morceaux à l’aide d’aiguilles à insuline pour identifier les follicules pré-antaux tardifs. Les follicules pré-antaux contiennent deux à trois couches de cellules de granulose et ont un diamètre d’environ 180 à 200 micromètres.

Disséquez l’un d’entre eux à l’aide d’une aiguille en ligne et d’une aiguille d’acupuncture fixée par un porte-aiguille, évitez d’endommager la lame basale, mais assurez-vous d’enlever le stroma S environnant. Cela demande de la pratique. Le follicule a besoin de tissu fécal, mais pas trop.

De plus, si le processus de dissection est trop brutal, le follicule est endommagé et se rompt ou meurt. Pendant la culture, l’utilisateur a préparé la perpe pour transférer soigneusement les follicules dans un nouveau verre de montre rempli de moyen. Maintenez les follicules sur la section de calibre mince du perpet à l’aide d’un oculaire calibré monté sur un microscope à dissection.

Mesurez les follicules. S’ils sont à moins de 10 micromètres d’un diamètre de 190 micromètres. Ils peuvent être utilisés pour la culturation, jetez les autres follicules des follicules sélectionnés.

Choisissez uniquement les plus sains pour la culture. Ils doivent être translucides sans zones retiques plus foncées, avoir une lamelle basale intacte et un peu de tissu thécal attaché. Un bon rendement est de 10 à 15 follicules par ovaire.

Maintenant, à l’aide d’une perpe incurvée préparée, transférez ces follicules dans la plaque de culture préparée à 96 puits. Placez un follicule dans chaque puits sous la couche d’huile et la culture. Les follicules sont jusqu’à six jours par jour.

Préparez une nouvelle rangée avec du milieu. Une heure ou plus tard, transférez les follicules dans la rangée suivante de milieux équilibrés frais ou de follicules follicules co-cultivent deux follicules côte à côte en un. Eh bien, au lieu de transferts, utilisez un embout en gel fin pour changer la moitié du milieu tous les deux jours.

Pour l’ovaire folliculaire, les co-cultures transfèrent un follicule dans un ovaire néonatal placé sur une membrane dans une plaque de culture, placez soigneusement le follicule à côté d’un pôle de l’ovaire néonatal afin qu’ils puissent ensuite être mis en contact l’un avec l’autre. Maintenez cette culture jusqu’à cinq jours. Remplacement de 500 microlitres du milieu tous les deux jours.

Les follicules pré-antaux sont souvent encapsulés par les ovaires néonatals. Au cours de cette culture, les ovaires néonatals du nouveau-né ont été cultivés pendant six jours et exposés à des substances toxiques pour la reproduction. Le deuxième jour de la culture, les tissus ont été traités pour déterminer le nombre et la santé des différents stades des follicules.

Le cisplatine était un toxique étudié. L’autre toxique étudié était la doxorubicine. Une expérience différente a examiné l’effet de l’hormone folliculostimulante des gonadotrophines et de l’hormone lutéinisante sur la croissance des follicules individuels.

Mais cette analyse de la taille des follicules a été mesurée périodiquement pour cartographier leur croissance. La co-culture de follicules follicules a été étudiée à l’aide d’un follicule exprimant la GFP et d’un follicule de type sauvage, les processus s’étendent de l’un à l’autre. Le traitement immunohistochimique de cette co-culture a révélé que les processus GFP se situent dans les types sauvages.

Des ovaires néonatals de type sauvage ont également été co-cultivés avec le follicule exprimant la GFP. Dans ce scénario, les processus GFP ont migré à travers l’interstitium ovarien. La culture ovarienne néonatale est une méthode assez simple, mais attendez-vous à passer un certain temps à maîtriser la technique de dissection de follicules pré-antraux intacts non endommagés.

C’est essentiel à leur bon développement. Après la culture folliculaire, les ovocytes peuvent être fécondés par fécondation in vitro, après quoi les embryons peuvent être transférés dans des femelles pseudo enceintes et des jeunes vivants obtenus.