Name: De limagerie in situ de Ca du système nerveux entérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique in situ des neurones et cellules gliales du système nerveux entérique dans des préparations intestinales vivantes. Cette méthode permet d'étudier l'activité cellulaire en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) (à B. Gulbransen), de la subvention K12 HD065879 des National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women’s Health) (B. Gulbransen) et de fonds de démarrage de l’Université d’État du Michigan (B. Gulbransen).

REMARQUE: Les procédures suivantes impliquant les tissus des animaux de laboratoire sont conformes aux directives de l&#39;AVMA sur l&#39;euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvés à l&#39;avance par l&#39;Université Michigan State IACUC. 1. Préparation des tissus <ol><li> Anesthésier des animaux de recherche dans une chambre contenant 2,5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène ou en plaçant 3-5 ml d&#39;isoflurane liquide sur un matériau absorbant sur le sol de la chambre, assurant une barrière physique qui empêche les animaux de tout contact direct avec l&#39;isoflurane. Test de la profondeur de l&#39;anesthésie en pinçant le coussinet plantaire. NOTE: La profondeur de l&#39;anesthésie est jugée appropriée lorsqu&#39;il n&#39;y a pas réflexe de retrait de la patte postérieure. Une fois anesthésié appropriée, euthanasier la souris par dislocation cervicale </li><li> Placez l&#39;animal dans une position couchée et nettoyer la peau abdominale avec 70% d&#39;éthanol. Utilisez une pince pour pincer la peau abdominale ligne médiane et à utiliser des ciseaux chirurgicaux de faire un support de 6 cml incision le long de la ligne blanche pour exposer organes digestifs internes. </li><li> Utilisez une pince contondants pour localiser et d&#39;exposer l&#39;iléon à l&#39;intérieur du péritoine. Couper le mésentère iléal / colon avec des ciseaux et commencer à démêler l&#39;intestin. </li><li> Une fois que la longueur de l&#39;intestin est suffisamment démêlé, intercepte intestin distal de l&#39;estomac et le caecum proximal pour une préparation d&#39;iléon. Pour une grande préparation de l&#39;intestin grêle, le côlon distal couper le caecum et proximale au rectum. </li><li> Retirer rapidement le segment intestinal et le placer dans un bécher avec les médias DMEM / F12 complété avec le chlorhydrate de nicardipine 3 pm et 1 uM chlorhydrate de scopolamine (ci-après dénommé «médias») sur la glace. L&#39;ajout de ces inhibiteurs facilite microdissection avec ensuite une imagerie en paralysant l&#39;intestin muscle lisse. </li><li> segment Cut d&#39;intérêt (par exemple, le jéjunum, de l&#39;iléon, le côlon distal ou proximal) fondée sur des marqueurs anatomiques établies. Typiquement utilize tissu de l&#39;iléon distal ou le côlon distal. Cependant, utiliser la même procédure de base pour isoler, la charge et l&#39;image neurones et de la glie myentériques dans toutes les régions intestinales. </li><li> Retirer un petit segment (4-6 cm) du segment de l&#39;intestin désiré et le placer dans une boîte de Pétri Sylgard revêtu rempli avec les médias réfrigérés. </li><li> Fixez les extrémités proximales et distales du segment intestinal avec des épingles insectes et ouvrir le tube intestinal en faisant une ligne droite, la longueur couper le long de la frontière mésentérique. </li><li> Tissu à plat sous une légère tension avec le côté de la muqueuse et soigneusement disséquer couche muqueuse en utilisant une pince fine (# 5 et # 5/45 travail mieux) et très fines ciseaux à ressort Pin. REMARQUE: La suppression de la muqueuse peut être très traumatisant pour l&#39;ENS se est pas effectué correctement. Pour les préparations de qualité, prendre soin de limiter le retrait brusque de la muqueuse par déroulage ou grattage. La meilleure pratique consiste à soulever la muqueuse et couper en dessous avec des ciseaux fins. </li><li> Coupez le tissu en petits préparations (environ 0,5 cm 2) et broches dans des plats d&#39;imagerie (4 coins avec couche de muscle circulaire vers le haut) placé sur la glace avec des milieux frais. </li><li> Disséquer soigneusement loin muscle circulaire par les taquineries dehors avec des pincettes fines pour exposer le plexus myentérique. Évitez un étirement excessif. </li><li> Placez plat imagerie retour sur la solution de la glace et le changement du milieu frais. </li><li> Préparez 2 ml de mélange d&#39;enzymes par plat [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), la collagénase de type II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) dans les médias]. </li><li> Retirer les plats du glace et ajouter le mélange d&#39;enzymes de l&#39;étape 1.13. </li><li> Incuber à température ambiante pendant plats 15 min avec 5% de CO2 / 95% d&#39;air. </li><li> Préparations de tissus laver les médias 3 fois et coins re-Pin. </li></ol> 2. Chargement Fluo-4 Dye REMARQUE: Eviter photoblanchiment en travaillant avec la lumière limitée lors de la manipulation des colorants fluorescents et des tissus chargés de colorants indicateurs. <ol><li> Préparer 4 uM Fluo-4 solution de chargement. <ol><li> Ajouter 1,5 ml de milieu et 1,2 pi d&#39;une probénécide stocks 250 mM à une aliquote de 1,5 pl de 4 mM Fluo-4 stock. 4 mM de fluo-4 mère est préparée en ajoutant 11,4 pi de Pluronic F-127 (20% dans le DMSO; supplémenté avec 0,25% Cremaphor EL) à 50 pg de Fluo-4 AM. </li></ol></li><li> Incuber préparations Fluo-4 dans la solution de charge pendant 45 min dans un incubateur obscurité à 37 ° C. </li><li> Retirer de l&#39;incubateur et laver préparations médias 3 fois. </li><li> médias d&#39;échange pour les médias contenant 200 uM probénécide et incuber 15 min à 37 ° C avant l&#39;imagerie. NOTE: Le probénécide est un médicament qui inhibe les transporteurs de résistance multidrogue dans les neurones. L&#39;addition de ce médicament inhibe la capacité des neurones à extruder colorants et améliore étiquetage neuronale. Chargement en masse de Ca 2+ colorants indicateurs, en l&#39;absence de probénécide produit principalement gliale chargement de la cellule. L&#39;addition de probénécide permet la visualisation de réponses neuronales et gliales. </li><li> Préparer modification Kretampon de bs. <ol><li> Faire un tampon Krebs modifié de telle sorte que les concentrations finales (en mm) des composants sont comme suit: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, une pyruvique 8 glucose et acide (pH ajusté à 7,4 avec NaOH). Ajouter 3 uM nicardipine et 1 uM scopolamine à inhiber les contractions musculaires durant Ca 2+ imagerie et toute-monter dissections. </li></ol></li></ol> 3. imagerie et d&#39;analyse REMARQUE: Utilisez au moins une plate-forme d&#39;imagerie de base avec une source de lumière fluorescente, microscope, une caméra CCD de qualité et un logiciel d&#39;acquisition appropriée. Varier l&#39;addition d&#39;autres composants en fonction de la source de lumière et de l&#39;application spécifique. Une roue de filtre et l&#39;obturateur doit être utilisé avec une source de lumière classique à arc au xénon. Cependant, les sources de lumière à LED et des systèmes d&#39;éclairage ne nécessitent pas ces composants. <ol><li> Placez le recchambre au microscope ording et en utilisant un système de perfusion à écoulement par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffée à établir un taux de perfusion en continu de 3.2 ml / min de 37 ° C tampon Krebs. Assurez-vous que pour éviter la formation de bulles d&#39;air à la fois dans la ligne d&#39;entrée et d&#39;aspiration reliée à un piège à vide. </li><li> Apportez le plexus souhaités dans le foyer sous un éclairage sur fond clair. Évitez les tissus, ce qui peut conduire à la photo blanchiment surexposition. </li><li> Examinez le Fluo-4 loading sein ganglions et sélectionnez ganglions sains pour l&#39;imagerie. Ganglions malsains / endommagées présenteront autofluorescence ou ponctuée morphologie et ne doivent pas être utilisés pour l&#39;imagerie. </li><li> Une fois ganglion est sélectionné, détourner trajet de la lumière à la caméra et obtenir des images en direct avec le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. Assurez-vous que ganglion est en discussion et régler taux d&#39;acquisition d&#39;image et temps d&#39;exposition. Note: l&#39;image tarifs et les délais d&#39;acquisition varient selon les événements enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, des imagessont traditionnellement acquis à 0,5-1 Hz pour les cellules gliales et jusqu&#39;à 2-10 Hz pour les neurones, car les réponses des cellules gliales Ca ne sont pas aussi rapides que Ca 2 + transitoires dans les neurones. </li><li> Commencez expérience et d&#39;établir l&#39;activité de base pendant 30 secondes. </li><li> Appliquer médicaments préchauffées d&#39;intérêt tels que les agonistes et antagonistes des récepteurs utilisant le système de perfusion d&#39;écoulement par gravité à une vitesse de 2-3 ml / min. Suivre application de agonistes / antagonistes en revenant à une perfusion du tampon normal et permettre une période d&#39;au moins 10 min de lavage / récupération. NOTE: Les heures d&#39;application du médicament peut varier en fonction du composé particulier et de la conception expérimentale. En général, une application de 20 à 30 sec agoniste est suffisante pour activer G récepteurs couplés aux protéines dans les neurones et les cellules gliales. Cependant, les canaux ioniques ligand-dépendants (tels que les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine) nécessitent des temps d&#39;application ne dépassant pas 5 à 10 sec. D&#39;autres expositions de durée causeront ligand canaux ioniques à ceux-ci rapidementnsitize. Antagonistes devraient être appliquées pendant environ 3-15 min pour assurer le blocage complet de voies des récepteurs. Cependant, ce est une généralisation grossière et les enquêteurs devraient toujours optimiser tout médicament expérimental dans leur paradigme particulier. </li><li> Arrêter l&#39;enregistrement et vue film accéléré de l&#39;expérience. Sélectionnez soigneusement les régions d&#39;intérêt (de ROI) en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image appropriée. </li><li> Utilisez un logiciel de normaliser et de comparer ROI intensité fluorescente contre sa valeur initiale de base fluorescente. Les variations de fluorescence normalisée sont directement proportionnelles aux variations de [Ca2 +]. <ol><li> Utiliser une modification d&#39;un procédé décrit précédemment en utilisant 26 AF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) de fond, où F1 est la fluorescence à ne importe quel donné Point et F0 est la fluorescence de base, pour améliorer la précision de l&#39;évaluation. Cette modification aidesen réduisant le bruit de la variation de fluorescence dans des préparations de tissus qui présentent mouvement de la couche musculaire sous-jacent le plexus myentérique. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodologies décrites dans ce manuscrit fournissent une approche cohérente pour étudier efficacement les neurones et la glie entérique dans le SNE. Bien que l’imagerie des neurones et de la glie entérique en culture ait permis de mieux comprendre la fonction des cellules individuelles, l’étude de ces cellules dans leur environnement natif et multicellulaire est cruciale pour notre compréhension de leur physiologie et de leur physiopathologie. La microscopie à fluorescence est une technique cruciale pour évaluer les interactions multidirectionnelles des cellules dans le SNE. Le chargement des cellules de l’ENS avec des marqueurs fluorescents sélectifs et l’acquisition d’images avec la microscopie à haute résolution permettent des observations quantitatives de l’activité cellulaire dans l’ENS. L’imagerie d’échantillons de tissus vivants de l’ENS est réalisée relativement rapidement et génère de grandes quantités de données fonctionnelles et spatiales approfondies. Les préparations myentériques et du plexus sous-muqueux de souris utilisées dans ces expériences permettent des approches de manipulation moléculaire et génétique. L’imagerie Ca2+ dans les préparations à montage entier fournit un outil utile pour l’évaluation des interactions neurones-glies.
Dans les paradigmes expérimentaux avancés, plusieurs sondes peuvent être combinées pour obtenir des informations sur différents événements au sein des cellules. La microscopie à fluorescence peut enregistrer des images avec un contraste amélioré de molécules spécifiques, si un marqueur fluorescent approprié est utilisé. Fluo-4 a été choisi parce qu’il possède une large plage dynamique. Un temps d’incubation suffisant est essentiel lors de l’utilisation des colorants AM dans le SNA. Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration et la méthode de chargement du colorant pour obtenir les meilleurs résultats. Les préparations idéales doivent être chargées avec suffisamment de colorant pour visualiser les changements de fluorescence, mais pas au point que le colorant chélate les ions cibles et interfère avec la signalisation intracellulaire. L’exposition à la lumière fluorescente doit être limitée pour éviter la phototoxicité dans les cellules et le photoblanchiment des colorants. 
Les chercheurs doivent être prudents avec plusieurs étapes de cette expérience, en particulier la préparation de la solution et des tissus. Une attention particulière doit être portée lors du traitement et de la dissection du tissu ENS afin de maintenir les fonctions cellulaires. Le tractus gastro-intestinal contient plusieurs couches et variétés de tissus, ce qui pose des défis pour la dissection et la qualité de l’imagerie dans ces préparations à montage entier 27. De plus, les faisceaux de fibres d’interconnexion du MP sont plus larges et les ganglions sont plus grands que ceux du SMP 2. La densité neuronale du plexus myentérique est plus élevée par rapport à celle du plexus sous-muqueux 28. Des dissections lentes et imprécises auront des effets néfastes sur la qualité des préparations du plexus et donc sur le succès global des expériences. Par conséquent, des outils propres ou non endommagés, de la pratique et une dextérité manuelle sont essentiels à cette procédure. 
Dans les préparations de tissus entiers, une attention particulière doit être prise lors du dessin des régions d’intérêt (ROI) pour évaluer correctement la cinétique et le degré de changement observé de l’intensité de fluorescence du type de cellule souhaité. Comme les ganglions sont situés sur une couche musculaire contractile, les artefacts de mouvement causés par la motilité intestinale sont une préoccupation majeure lors de l’imagerie in situ . Ainsi, la suppression de ces perturbations du mouvement par le réalignement des préparations tissulaires après l’incubation avec des enzymes et l’ajout d’inhibitions pharmacologiques (nicardipine/scopolamine) aux tampons permet une acquisition d’images claire et fiable. Outre les approches pharmacologiques et mécaniques visant à prévenir le mouvement des tissus, des études récentes illustrent l’application de méthodologies logicielles avancées et de caractéristiques de réponse du type cellulaire pour corriger le mouvement résiduel des tissus dans les enregistrements et améliorer la précision de l’analyse29. À l’exception de ces obstacles techniques, cette méthode fournit des conditions physiologiquement pertinentes pour évaluer les caractéristiques morphologiques et quantitatives des neurones et de la glie entérique dans le SNE.

Le système nerveux entérique (SNE) est organisé en deux plexus ganglionated intégrées dans la paroi du tube digestif 1. Ces circuits de neurones par voie intramusculaire, le plexus myentérique (MP) et la sous-muqueuse plexus (SMP), sont composés de neurones et de cellules gliales entérique (figure 1) 2. Le député et SMP réglementent gastro-intestinaux (GI) des fonctions telles que la motilité intestinale et l&#39;absorption épithéliale et la sécrétion, respectivement 3. Glie entérique sont situés à proximité de neurones dans les ganglions mais les populations de cellules gliales entériques existe également dans l&#39;interconnexion des faisceaux de fibres et des portions extra-ganglionnaires de la paroi intestinale 3,4. Glie entériques on croyait à l&#39;origine pour fournir qu&#39;une aide nutritive pour les neurones. Cependant, des études récentes suggèrent fortement que les interactions neurone-glie sont essentiels pour les fonctions ENS 5,6. Par exemple, les données montrent que les cellules gliales entériques &quot;écouter&quot; à l&#39;activité neuronale 7et de moduler les circuits neuronaux 6,8, protéger les neurones entériques du stress oxydatif et 9 sont capables de générer de nouveaux neurones entériques en réponse à des blessures 10,11. Le protocole présenté dans cette revue technique fournit une méthode simple et robuste pour examiner l&#39;interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales entériques utilisant in situ intracellulaire de Ca 2+ imagerie. Ca 2+ est une molécule de signalisation omniprésente dans les cellules excitables et joue un rôle essentiel dans les événements de signalisation synaptiques dans le système nerveux 12. L&#39;excitation des neurones ou des cellules gliales entériques provoque une élévation de la concentration en Ca2 + cytoplasmique soit par influx par Ca2 + Les canaux -permeable ou Ca 2+ libération de réserves de calcium intracellulaire. Imagerie Ca 2 + transitoires dans les neurones et les cellules gliales avec des colorants fluorescents est établi et technique largement utilisée pour étudier l&#39;organisation et la dynamique des fonctionnellel&#39;ENS 13-17. Ca de l&#39;imagerie a été montré pour être un outil important dans l&#39;étude de segments de tissu IG intactes pour élucider la propagation de l&#39;excitabilité à travers les réseaux de stimulateur de la CPI et 18 intestin muscle lisse 19,20. Il permet aux chercheurs de sonder un large éventail de paramètres physiologiques et fournit des informations à la fois sur leur répartition spatiale et dynamique temporelle. Les cellules peuvent être efficacement colorées de manière mini-invasive en utilisant des indicateurs fluorescents membrane perméable et protocoles de coloration optimisés 21. Ceci offre la possibilité de contrôler un grand nombre de neurones et les cellules gliales dans des préparations entériques fonctionnellement conservés 14-16,22, ainsi que in vivo 23. -Monter entiers préparations de tissus sont en vrac chargés avec une haute affinité Ca 2+ colorant indicateur comme Fluo-4 qui augmente sa fluorescence lorsqu&#39;il est lié à Ca 2+. Les variations de fluorescence sont enregistrées par une caméra CCD et analysées numériquement 6. L&#39;avènement de Ca2 + a été l&#39;occasion de surveiller neurones et cellules gliales interactions, la réactivité aux différents stimuli, et la participation de ces types de cellules dans les processus gastro-intestinaux en temps réel. In situ de l&#39;imagerie Ca a donné une grande perspicacité dans les mécanismes de signalisation des neurones entériques et de la glie et possède plusieurs avantages distincts par rapport aux modèles de culture cellulaire 6,24. Tout d&#39;abord, in situ préparations maintenir l&#39;environnement de la matrice native de neurones et cellules gliales et laissent l&#39;essentiel de leurs connexions à cibler tissu intact. Deuxièmement, la génétique et la morphologie des cellules gliales entériques cultivées sont sensiblement modifiées par rapport à 6,24 in vivo. Troisièmement, de nombreuses interactions hétérotypiques sont perdus dans la culture de cellules primaires, ce qui limite l&#39;évaluation des interactions entre les cellules. Bien que les cellules cultivées sont bien adaptés pour l&#39;étude des propriétés fondamentales, leur usefulness pour étudier les interactions complexes entre les cellules gliales et neurones entériques est limité. Enquête interaction neurone-glie en utilisant une approche in situ est plus physiologiquement pertinente que les voies synaptiques demeurent intacts 25. Par rapport aux approches de culture cellulaire, une approche in situ offre de meilleures conditions pour comprendre systématiquement les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques. En outre, l&#39;organisation planaire du plexus ganglionated dans des préparations entières montage est idéal pour l&#39;imagerie de fluorescence de Ca2 + intracellulaire transitoires et cette technique offre une approche simple pour évaluer l&#39;activité des neurones-glie dans l&#39;ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Chauffe-seringue&nbsp ;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type II, poudre</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Outils de dissection</td><td>Roboz&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à platine fixe</td><td>Olympus&nbsp ;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM colorant</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>Pin’s Minutien iQ</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie de cellules vivantes</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo Caméra sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Chambre</td> <td>de perfusion</td> Pompe péristaltique personnalisée <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td></td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamine</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp ;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

de l&#39;imagerie in situ de ca du système nerveux entérique

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Les comportements réflexes de l’intestin sont contrôlés par le système nerveux entérique (SNE). Le SNE est un réseau intégratif de neurones et de cellules gliales dans deux plexus ganglionnaires logés dans la paroi intestinale. Les neurones entériques et la glie entérique sont les seuls types de cellules à l’intérieur des ganglions entériques. L’activité des neurones entériques et de la glie est responsable de la coordination des fonctions intestinales. Ce protocole décrit des méthodes d’observation de l’activité des neurones et de la glie dans le SNE intact en imageant les transitoires calciques intracellulaires (Ca2+) avec des colorants indicateurs fluorescents. Notre discussion technique porte sur les méthodes d’imagerie Ca2+ dans les préparations entières du plexus myentérique de l’intestin de rongeur. La charge en vrac de montures entières ENS avec un indicateur Ca2+ de haute affinité tel que Fluo-4 permet de mesurer les réponses Ca2+ dans des neurones individuels ou des cellules gliales. Ces réponses peuvent être évoquées de manière répétée et fiable, ce qui permet des études quantitatives à l’aide d’outils pharmacologiques. Les réponses Ca2+ dans les cellules de l’ENS sont enregistrées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) refroidie. Les mesures de fluorescence obtenues à l’aide de l’imagerie Ca2+ dans des préparations entières offrent un moyen simple de caractériser les mécanismes et les conséquences fonctionnelles potentielles des réponses Ca2+ dans les neurones entériques et les cellules gliales.

Bonne utilisation de cette technique permet aux enquêteurs de mesurer avec précision intracellulaire de Ca 2+ [Ca2 +] i transitoires dans les neurones entériques et de la glie dans l&#39;ensemble du montage des préparations de tissus. Un exemple représentatif d&#39;un agoniste-évoqué Ca 2+ réponses dans les cellules gliales dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris est montré dans la vidéo 1. Les résultats suivants sont destinés à illustrer certains résultats représentatifs que nous avons obtenus en utilisant cette méthode. Tout d&#39;abord, la figure 2 illustre les résultats d&#39;une expérience de mesure gliale entérique [Ca2 +] i change en réponse à une stimulation par l&#39;ATP à l&#39;intérieur du côlon Guinée porcs longitudinal plexus myentérique musculaire (LMMP préparations). Plus précisément, cette figure montre la méthode pour analyser correctement le protocole expérimental ci-dessus y compris le contour du ganglion et les astérisques indiquant l&#39;emplacement des neurones entériques myentérique analysé. Ces résultats ont également illustrate la dose optimale de cent micromolaire ATP sur la mobilisation de [Ca 2+] i dans les cellules gliales myentérique cochon Guinée. Cette réponse peut être utilisé pour étalonner la stimulation des cellules gliales entériques et normaliser les réponses aux stimuli tester. Ensuite, la Figure 3 met en lumière comment sélectionner correctement régions d&#39;intérêt (ROI) entourant les cellules gliales, montré avec entourant cercles jaunes. Ces résultats montrent également les changements de fluorescence souhaités dans des conditions basales et en réponse à des stimuli pharmacologiques. Enfin, la figure 4 montre les considérations spatiales pour choisir les cellules gliales et neurones entériques pour [Ca2 +] i réponses dans des préparations entières-monter. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figure 1. Organisation de l&#39;ENS. L&#39;ENS contient deux grands plexus ganglionated. Le plexus myentérique est situé entre le longitudinal couches musculaires et circulaires. Le plexus sous-muqueux est situé entre la muqueuse et la couche musculaire circulaire. L&#39;ENS est exclusivement composée de neurones et cellules gliales entériques. faisceaux de fibres nerveuses relient les ganglions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figure 2. entérique cellules gliales dans le cochon Guinée colique plexus myentérique répondre à l&#39;ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescence dans un ganglion mésentérique (délimitée par la ligne pointillée) dans des conditions basales. Les flèches indiquent épais faisceaux de fibres interganglionic. (B) Lors de la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales, mais pas les neurones, augmentent rapidement Fluo-4 fluorescence indiquant une augmentation de [Ca 2+] <sub&gt; i. Notez que les cellules répondant sont petites et entourent les neurones beaucoup plus grandes (espaces sombres marquées par des astérisques). (C) des cellules gliales entériques répondre à l&#39;ATP d&#39;une manière dose-dépendante avec 1 mmol / L déclencher des réponses maximales 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figure 3. murin S-100 cellules GFP + dans le plexus myentérique du côlon répondent à l&#39;ATP in situ. (A) S-100-GFP + cellules gliales (vert) dans un ganglion mésentérique du côlon de la souris (décrites par la ligne pointillée). Six régions d&#39;intérêt (ROI) entourant les cellules gliales dans les ganglions sont présentés sous forme de cercles jaunes. Les flèches indiquent des faisceaux de fibres épaisses menant dans le ganglion. Astérisques dLieu de enote de deux neurones entériques. (B) Même ganglion montrant Rhod-2 fluorescence dans des conditions basales. (C) Suite à la stimulation avec 100 pmol / L ATP, les cellules gliales répondent à une augmentation [Ca 2+] i comme indiqué par l&#39;augmentation Rhod- 2 fluorescence. (D) traces correspondant à chaque ROI montré dans l&#39;A-C. (E) en moyenne réponse (moyenne ± SEM) des six ROI indiquées dans D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figure 4. En imagerie in situ de la communication entérique neurone-glie à. (A) Des images représentatives (de pseudocolored) d&#39;une expérience d&#39;imagerie Ca 2+ où l&#39;ensemble du montagepréparation du plexus myentérique a été contestée avec le neuronale agoniste du récepteur P2X7 BzATP (100 uM, 30 sec). Notez que l&#39;agoniste neuronale entraîne une augmentation de Fluo4 fluorescence dans le neurone (A &#39;) avant les cellules environnantes entériques gliales (A &quot;). (B) Analyse de la variation de fluorescence au cours du temps dans les cellules gliales (bleu) et les neurones (rouge ) après l&#39;application de l&#39;agoniste neuronal, BzATP. (C) et les réponses neuronales gliales dans le tampon de BzATP normale (traits pleins) et dans un tampon contenant faible Ca 2+ et Mg 2+ (lignes en pointillés) de potentialiser récepteurs P2X7 13 neuronales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1. agoniste évoqué Ca 2+ réponse dans les cellules gliales entériques danssitu. Cette vidéo montre un ganglion mésentérique du côlon distal de la souris chargé avec le Ca de l&#39;indicateur colorant, Fluo-4. L&#39;agoniste des cellules gliales, ADP, est ajouté au bain lorsque cela est indiqué. ADP provoque une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca 2+ dans les cellules gliales entériques comme observé par l&#39;élévation transitoire de Fluo-4 fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a>

Le système nerveux entérique (SNE) est un réseau de neurones et de glies situé dans la paroi intestinale qui contrôle les réflexes intestinaux. Ce protocole décrit des méthodes d’enregistrement de l’activité des neurones entériques et de la glie dans des préparations vivantes de SNE à l’aide de l’imagerie Ca2+.

De l&#39;imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer l'activité des neurones et des cellules gliales entériques dans des préparations entières vivantes d'intestin à l'aide de colorants fluorescents indicateurs de calcium. Cette étape est réalisée en excisant d'abord une portion d'intestin de l'animal et en la plaçant dans un milieu préchauffé. La deuxième étape consiste à ouvrir l'intestin le long du bord mésentérique et à le fixer à plat sous une légère tension, avec la surface muqueuse orientée vers le haut.Des préparations en montage complet du plexus myentérique sont préparées par microdissection et placées dans des boîtes de microscopie. Ensuite, les préparations en montage complet sont chargées avec un colorant indicateur fluorescent flu oh four dans un incubateur. Dans les étapes finales, les préparations chargées sont observées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra haute résolution, contrôlée par un logiciel d’acquisition et d’analyse d’images, afin d’enregistrer l’activité de base.Ensuite, les médicaments faisant l'objet de l'étude sont ajoutés et les transitoires calciques dans les neurones et les cellules gliales sont enregistrés, en définitive in situ. L'imagerie calcique du système nerveux entérique est utilisée pour étudier la manière dont l'activité cellulaire des neurones et des cellules gliales contribue à la régulation des fonctions intestinales physiologiques ainsi qu'au dysfonctionnement du système nerveux entérique en pathophysiologie intestinale.Les implications de cette technique vont dans le sens d'une meilleure compréhension de la physiologie et de la physiopathologie des troubles fonctionnels intestinaux et de la maladie inflammatoire de l'intestin, grâce à une méthode simple et robuste permettant d'étudier les interactions complexes entre les neurones et les cellules gliales entériques à l'aide de l'imagerie calcique en deux photons. La démonstration de cette procédure sera offerte gratuitement aux scientifiques par mon laboratoire. Les procédures suivantes, impliquant des tissus provenant d'animaux de laboratoire, sont conformes aux lignes directrices de l'A VMA sur l'euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvées au préalable par le comité I-A-C-U-C de la Michigan State University. Après avoir euthanasié l'animal selon les procédures approuvées, placer l'animal en position supine et désinfecter la peau de l'abdomen avec de l'éthanol à 70 %. Utiliser une pince pour pincer la peau abdominale au niveau de la ligne médiane, puis utiliser des ciseaux chirurgicaux pour pratiquer une incision médiane de six centimètres le long de la ligne médiane, afin d'exposer les organes digestifs internes.Ensuite, utilisez une pince effilée pour localiser et exposer le côlon à l'intérieur du péritoine. Coupez le mésentère iléocôlonique avec des ciseaux et commencez à dérouler l'intestin. Une fois que la longueur de l'intestin est suffisamment déroulée, sectionnez le côlon en aval du cæcum et en amont du rectum pour une préparation du gros intestin, qui sera montrée dans cette vidéo.Ensuite, retirez rapidement le segment intestinal et placez-le dans un bécher contenant du milieu DM EMF 12 supplémenté avec trois micromoles de chlorhydrate de nicardipine et un micromole de chlorhydrate de S-scopolamine, mis sur de la glace. L'ajout de ces inhibiteurs facilite la microdissection et l'imagerie ultérieure en paralysant le muscle lisse intestinal. Prélevez un petit segment de quatre à six centimètres du segment intestinal souhaité et placez-le dans une boîte de Pétri recouverte de Sylgard et remplie de milieu supplémenté refroidi.Ensuite, fixez les extrémités proximale et distale du segment intestinal à l'aide d'épingles à insectes et ouvrez le tube intestinal en effectuant une incision droite dans le sens longitudinal le long du bord mésentérique. Épinglez ensuite le tissu à plat sous une légère tension, avec la muqueuse orientée vers le haut, et disséquez soigneusement la couche muqueuse en soulevant la muqueuse avec une pince fine de numéro cinq et en coupant en dessous à l’aide de ciseaux à ressort très fins. Découpez le tissu en préparations plus petites d’environ 0,5 centimètre carré et placez chaque morceau dans une boîte d’imagerie remplie de milieu supplémenté, puis mettez-la sur de la glace.Épingler chaque préparation aux quatre coins, avec la couche musculaire circulaire orientée vers le haut. Dissecter soigneusement le muscle circulaire en le séparant délicatement à l’aide de fines pinces. Pour exposer le plexus myentérique, éviter toute extension excessive, replacer les boîtes d’imagerie sur de la glace et remplacer la solution dans chaque boîte par un milieu frais supplémenté.Ensuite, retirez les boîtes de la glace et ajoutez deux millilitres de mélange enzymatique à chaque boîte, puis incubez à température ambiante avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air pendant 15 minutes. Enfin, lavez les préparations tissulaires avec le milieu trois fois et rincez les coins tout en travaillant dans des conditions de lumière limitée afin d'éviter le photoblanchiment, en ajoutant 1,5 millilitre de milieu supplémenté et 1,2 microlitre d'une solution mère de probit à 250 millimolaire à 1,5 microlitre d'une solution mère d'Eloqua de Fluro quatre à quatre millimolaire, pour obtenir environ 1,5 millilitre de solution de chargement de flu oh quatre, que l'on ajoute aux boîtes d'imagerie. Incubez ensuite dans un incubateur obscurci à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Après avoir retiré les boîtes de l'incubateur, lavez les préparations trois fois avec le milieu.Ensuite, ajouter du milieu frais contenant 200 micromolaire d'acide propionique pour améliorer le marquage neuronal et incuber comme précédemment pendant 15 minutes. Pendant l'incubation, préparer un tampon de Krebs modifié selon les instructions de la partie écrite du protocole, et ajouter trois micromolaires de nicardipine et un micromolaire de scopolamine afin d'inhiber les contractions musculaires. Pendant l'imagerie au calcium deux plus et les dissections en montage entier, placer la chambre d'enregistrement sous le microscope à fluorescence et utiliser un système de perfusion par gravité équipé de plusieurs réservoirs de seringues chauffés.Établir un débit de perfusion continu de deux à trois millilitres par minute de tampon de Krebs à 37 degrés Celsius. Veiller à prévenir la formation de bulles d'air dans la ligne d'entrée ainsi que dans la ligne d'aspiration connectée à un piège sous vide. Mettre le plexus souhaité au point sous éclairage en champ clair.Évitez une exposition excessive du tissu, ce qui pourrait entraîner un photoblanchiment. Examinez le chargement du fluo 4 dans les ganglions et sélectionnez les ganglions sains pour l'imagerie. Les ganglions endommagés ou non viables présenteront une autofluorescence ou une morphologie ponctuée et ne doivent pas être utilisés pour l'imagerie.Une fois un ganglion sélectionné, dériver le trajet de la lumière vers la caméra et obtenir une image en direct. À l’aide d’un logiciel d’acquisition d’image, s’assurer que le ganglion est en netteté et régler la fréquence d’acquisition d’image et les temps d’exposition. Les fréquences et durées d’acquisition d’image varient selon les événements que les chercheurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, les images sont traditionnellement acquises à une fréquence de 0,5 à un hertz pour les cellules gliales, et jusqu’à deux à dix hertz.Pour les neurones, étant donné que les transitoires calciques gliaux ne sont pas aussi rapides que les transitoires calciques des neurones, commencez l'enregistrement et établissez une activité physiologique de base du ganglion sélectionné en l'absence de stimuli expérimentaux pendant 30 secondes. Appliquez ensuite les substances d'intérêt préalablement réchauffées, telles que des agonistes ou des antagonistes récepteurs, à l'aide du système de perfusion par gravité à un débit de deux à trois millilitres par minute, selon un protocole optimisé pour votre substance. Arrêtez l'enregistrement et visionnez le film en accéléré de l'expérience.Sélectionnez attentivement les régions d'intérêt ou ROI à l'aide du logiciel d'analyse d'image approprié. Enfin, utilisez un logiciel d'imagerie adéquat pour normaliser et comparer l'intensité fluorescente des régions d'intérêt par rapport à leur valeur de base initiale. Les variations de la fluorescence normalisée sont directement proportionnelles aux changements de calcium. Les trois images suivantes démontrent que les cellules gliales entériques du cobaye répondent à un TP in situ.Dans des conditions basales, un faible niveau de fluorescence au fluoro quatre, indiqué par la ligne pointillée, est visible. Les flèches montrent des faisceaux fibreux interganglionnaires épais ; après stimulation par 100 µmol/L d'ATP, les cellules gliales, mais pas les neurones, augmentent rapidement la fluorescence au fluoro quatre, indiquant une augmentation du calcium. Notez que les cellules réactives sont petites et entourent les neurones nettement plus gros, indiqués par les espaces sombres marqués d'un astérisque.Cet histogramme montre que les cellules gliales entériques répondent à un TP de manière dépendante de la dose, une concentration de un millimole par litre induisant des réponses maximales. Cette vidéo montre un ganglion myentérique du côlon distal de souris chargé avec un colorant indicateur de calcium deux plus, flu oh quatre. L'agoniste des cellules gliales, l'A DP, est ajouté au bain au moment indiqué.Un DP provoque une augmentation du calcium intracellulaire deux plus dans les cellules gliales entériques, comme observé par l'élévation transitoire de la fluorescence du flu oh quatre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'examiner précisément l'interaction complexe entre les neurones et les cellules gliales en utilisant l'imagerie calcique. La caractérisation des mécanismes et des conséquences fonctionnelles potentielles des réponses calciques dans des préparations en montage complet nécessite des dissections précises afin d'obtenir une qualité d'imagerie optimale.L'utilisation d'un marquage fluorescent et de stimuli pharmacologiques dans cette technique basée sur la microscopie permet une évaluation améliorée de ces cellules dans leur environnement multicellulaire naturel.

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Ce protocole illustre comment la tension colorants sensibles pour permettre l'enregistrement optique de l'activité électrique de réseaux de neurones intacts tels que les réseaux de la Guinée-cochon système nerveux entérique, avec une résolution réglable allant de simples cellules à multi-ganglionnaires circuits.

Enregistrement optique de l&#39;activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

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Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la lamina propria d’une souris

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Source : Fried, D. E., Gulbransen, B. D. Imagerie in situ ca2+. J. vis. exp. exp.  (2015)Cette vidéo démontre le calcium imagerie pour visualiser et analyser l’activité des neurones entériques et de la glie dans les préparations du plexus myentérique colique de souris.

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Nous démontrons un protocole de culture cellulaire pour l’étude directe des composants neuronaux et gliaux du système nerveux entérique. Une culture mixte neurone/glie sur lamelles de recouvrement est préparée à partir du plexus myentérique de souris adulte, ce qui permet d’examiner la fonction individuelle des neurones et de la glie par électrophysiologie, immunohistochimie, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

Le système nerveux entérique est formé par des cellules de la crête neurale qui prolifèrent, migrent et colonisent l’intestin. Les cellules de la crête neurale se différencient en neurones avec des marqueurs spécifiques de leur phénotype de neurotransmetteur. Ce protocole décrit une technique de dissection, de fixation et d’immunocoloration du tractus gastro-intestinal embryonnaire murin afin de visualiser l’expression des neurotransmetteurs du système nerveux entrique.

Immunocoloration à Visualisez murin nerveux entérique développement du système

Cet article décrit une technique d’imagerie vidéo et de cartographie spatio-temporelle à haute résolution pour identifier les changements dans la régulation neuronale de la motilité colique chez les souris adultes. Des effets subtils sur la fonction gastro-intestinale (GI) peuvent être détectés à l’aide de cette approche dans des préparations de tissus isolés pour faire progresser notre compréhension de la maladie gastro-intestinale.

Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d&#39;analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

Les nerfs afférents mésentériques transmettent des informations du tractus gastro-intestinal vers le cerveau concernant l’homéostasie normale ainsi que la physiopathologie. L’activité nerveuse afférente gastro-intestinale peut être évaluée en montant des segments intestinaux isolés avec des nerfs afférents attachés dans un bain d’organe, en isolant le nerf et en évaluant l’activité basale et stimulée.

In vitro Enregistrement de mésentérique Afférent activité nerveuse chez la souris jéjunale et Segments colique

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Découvrez l'imagerie calcique in situ des neurones et cellules gliales du système nerveux entérique dans des préparations intestinales vivantes. Cette méthode permet d'étudier l'activité cellulaire en temps réel.

De l'imagerie in situ ^de Ca du système nerveux entérique

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