De l'imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

L’objectif général de cette procédure est d’imager l’activité des neurones entériques et des cellules gliales dans des préparations vivantes entières de l’intestin à l’aide de colorants indicateurs de calcium fluorescents. Pour ce faire, on excèse d’abord une partie de l’intestin de l’animal et on la place dans un milieu préchauffé. La deuxième étape consiste à ouvrir l’intestin le long du bord mésentérique et à le fixer à plat sous une légère tension avec une surface muqueuse vers le haut.

Les préparations du plexus myentérique sont préparées par microdissection et placées dans des boîtes d’imagerie. Ensuite, l’ensemble des préparations de montage est chargé avec un colorant indicateur fluorescent de grippe oh quatre dans un incubateur. Dans les dernières étapes, les préparations chargées sont imagées à l’aide d’un microscope imageur fluorescent équipé d’une caméra haute résolution contrôlée par un logiciel d’acquisition et d’analyse d’images pour enregistrer l’activité de base.

Ensuite, les médicaments à l’étude sont ajoutés et les transitoires de calcium dans les neurones et les cellules gliales sont enregistrés. Finalement in situ. L’imagerie calcique du système nerveux entérique est utilisée pour étudier comment l’activité cellulaire dans les neurones et la glie contribue à la régulation des fonctions physiologiques de l’intestin et au dysfonctionnement du système nerveux entérique dans la physiopathologie intestinale.

Les implications de cette technique s’étendent à l’établissement d’une compréhension de la physiologie et de la physiopathologie des troubles intestinaux fonctionnels et des maladies inflammatoires de l’intestin grâce à l’utilisation d’une méthode simple et robuste pour examiner l’interaction complexe entre les neurones et la glie entérique à l’aide de l’imagerie calcique NC deux démontrant que cette procédure sera libre pour les scientifiques de mon laboratoire. Les procédures suivantes impliquant des tissus d’animaux de laboratoire sont conformes aux directives de l’A VMA pour l’euthanasie des animaux de 2013 et ont été approuvées à l’avance par l’Université d’État du Michigan I-A-C-U-C Après avoir euthanasié l’animal conformément aux procédures approuvées, placez l’animal en position couchée et nettoyez la peau de l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez une pince pour pincer la peau abdominale au milieu de la ligne, puis utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision médiale de six centimètres le long du coude linéaire afin d’exposer les organes digestifs internes.

Ensuite, utilisez une pince émoussée pour localiser et exposer le côlon à l’intérieur du péritoine. Coupez le mésentère du côlon iléal avec des ciseaux et commencez à démêler l’intestin. Une fois que la longueur de l’intestin est correctement démêlée, coupez le côlon distal au caecum et proximal au rectum pour une préparation du gros intestin, qui sera montrée dans cette vidéo.

Ensuite, retirez rapidement le segment intestinal et placez-le dans un bécher contenant du milieu DM EMF 12 complété par trois micromolaires de chlorhydrate de nicardipine et un chlorhydrate micromolaire de scopolamine S sur de la glace. L’ajout de ces inhibiteurs facilite la microdissection et l’imagerie ultérieure en paralysant le muscle lisse de l’intestin. Retirez un petit segment de quatre à six centimètres du segment d’intestin souhaité et placez-le dans une boîte de Pétri recouverte d’un protecteur syl rempli de milieux supplémentaires réfrigérés.

Fixez ensuite les extrémités proximale et distale du segment intestinal à l’aide d’épingles à insectes et ouvrez le tube intestinal en faisant une coupe droite dans le sens de la longueur le long de la bordure mésentérique. Maintenant, épinglez le tissu à plat sous une légère tension avec une muqueuse vers le haut et disséquez soigneusement la couche muqueuse en soulevant la muqueuse avec la pince fine numéro cinq et en coupant en dessous avec des ciseaux à ressort très fins. Coupez le tissu en petites préparations d’environ 0,5 centimètre carré et placez chaque morceau dans une boîte d’imagerie remplie de milieux supplémentaires et placez-le sur de la glace.

Épinglez chaque préparation aux quatre coins avec une couche musculaire circulaire vers le haut. Disséquez soigneusement le muscle circulaire en le séparant à l’aide d’une pince à épiler fine. Pour exposer le plexus myentérique, évitez un étirement excessif, remettez les boîtes d’imagerie sur de la glace et remplacez la solution dans chaque boîte par un milieu frais supplémenté.

Ensuite, retirez la vaisselle de la glace et ajoutez deux millilitres de mélange d’enzymes dans chaque plat et incubez à température ambiante avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 15 minutes. Enfin, lavez les préparations de tissus avec un milieu trois fois et rayez les coins tout en travaillant dans des conditions de lumière limitée pour éviter le photoblanchiment à 1,5 millilitre de milieu supplémenté et 1,2 microlitre d’un probit de 250 millimolaires à un 1,5 microlitre Eloqua de quatre millimoles Fluro quatre stock à environ 1,5 millilitres de grippe ou quatre de solution de chargement dans les boîtes d’imagerie et incubez dans un incubateur sombre à 37 degrés Celsius pendant 45 compte-rendu. Après avoir sorti la vaisselle de l’incubateur, lavez les préparations trois fois avec des fluides.

Ajoutez ensuite un milieu frais contenant 200 micromolaires de propacide pour améliorer le marquage neuronal neural et incubez comme précédemment pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, préparez un tampon Krebs modifié selon les instructions de la partie écrite du protocole, et ajoutez trois micromolaires de nicardipine et une micromolaire scopolamine pour inhiber les contractions musculaires. Pendant l’imagerie du calcium deux plus et les dissections à monture entière, placez la chambre d’enregistrement sous le microscope fluorescent et à l’aide d’un système de perfusion par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffés.

Établissez un taux de perfusion continu de deux à trois millilitres par minute de tampon de 37 degrés Celsius. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles d’air dans la conduite d’entrée et la conduite d’aspiration reliée à un piège à vide. Faites la mise au point sur le plexus souhaité sous un éclairage en fond clair.

Évitez de surexposer les tissus, ce qui pourrait entraîner un photoblanchiment. Examinez la grippe ou quatre charges dans les ganglions et sélectionnez des ganglions sains pour l’imagerie. Les ganglions endommagés malsains présenteront une autofluorescence ou une morphologie ponctuée et ne doivent pas être utilisés pour l’imagerie.

Une fois qu’un ganglion est sélectionné, déviez le chemin de la lumière vers la caméra et obtenez une image en direct. Avec un logiciel d’acquisition d’images, assurez-vous que le ganglion est net et réglez le taux d’acquisition d’images et les temps d’exposition Les taux et les temps d’acquisition d’images varieront en fonction des événements que les enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, les images sont traditionnellement acquises à 0,5 à un hertz pour les cellules gliales et jusqu’à deux à 10 hertz.

Pour les neurones, étant donné que les transitoires calciques gliaux ne sont pas aussi rapides que les neurones transitoires calciques, démarrez l’enregistrement et établissez l’activité physiologique de base du ganglion choisi en l’absence de stimuli expérimentaux pendant 30 secondes. Appliquez ensuite les médicaments préchauffés d’intérêt tels que les agonistes et les antagonistes des récepteurs à l’aide du système de perfusion à flux gravitaire à un rythme de deux à trois millilitres par minute selon un protocole optimisé pour votre médicament. Arrêtez l’enregistrement et visionnez la vidéo en accéléré de l’expérience.

Sélectionnez soigneusement les régions d’intérêt ou les zones d’intérêt à l’aide du logiciel d’analyse d’images approprié. Enfin, utilisez un logiciel d’imagerie approprié pour normaliser et comparer l’intensité fluorescente des régions d’intérêt par rapport à sa valeur de référence initiale. Les changements de fluorescence normalisée sont directement proportionnels aux changements de calcium. Les trois images suivantes montrent que la glie entérique chez le cobaye répond à une TP in situ.

Dans des conditions basales, une fluorescence de quatre de faible niveau, délimitée par la ligne pointillée, est visible. Les flèches pointent vers d’épais faisceaux de fibres interganglionnaires lors de la stimulation avec 100 micro mo par litre A TP cellules gliales, mais pas les neurones augmentent rapidement la fluorescence quatre indiquant une augmentation du calcium. Notez que les cellules répondantes sont petites et entourent les neurones beaucoup plus grands indiqués par les espaces sombres marqués d’un astérisque.

Cet histogramme montre que les cellules gliales entériques répondent à une TP de manière dose-dépendante avec un millimètre mole par litre provoquant des réponses maximales. Cette vidéo montre un ganglion myentérique du côlon distal de la souris chargé d’un colorant indicateur de calcium deux plus la grippe oh quatre. L’agoniste des cellules gliales, un DP, est ajouté au bain lorsque cela est indiqué.

Un DP provoque une augmentation du calcium intracellulaire deux plus dans la glie entérique, comme observé par l’élévation transitoire de la fluorescence de la grippe oh quatre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’examiner avec précision l’interaction complexe entre les neurones et l’utilisation empirique de l’imagerie calcique. La caractérisation des mécanismes et des conséquences fonctionnelles potentielles des réponses calciques dans les préparations de montage entier nécessite des dissections précises pour une qualité d’imagerie idéale.

L’utilisation d’un marquage fluorescent et de stimuli pharmacologiques dans cette technique basée sur la microscopie permet une meilleure évaluation de ces cellules dans leur environnement multicellulaire natif.