Livraison de In Vivo Aiguë intermittente hypoxie néonatale dans Rongeurs au Premier-ventriculaire Zone dérivés de cultures de cellules progénitrices neurales

Cet article décrit la méthodologie de l'administration de courtes périodes de hypoxie intermittente à jour 1-8 rat ou de souris chiots postnatales. Cette approche suscite effectivement un niveau de tissu robuste »d'amorçage effet" sur les cellules progénitrices neurales cultivées qui sont récoltées dans les 30 min d'exposition à l'hypoxie.

L’objectif global de cette procédure est d’initier les rongeurs néonatals à des épisodes intermittents de baisse légère et brève des niveaux d’oxygène. Pour ce faire, on rince d’abord les chambres de pléthysmographie avec 21 % d’oxygène de l’air ambiant pendant deux minutes. Dans la deuxième étape, le gaz d’entrée est rapidement transformé en un mélange d’hypoxie de 10 % d’oxygène pendant deux minutes.

Le cycle est ensuite répété 20 fois, produisant un protocole d’hypoxie intermittente aiguë. Dans la dernière étape, les cellules souches neurales et les cellules progénitrices récoltées sur les animaux traités sont récoltées pour la culture ultérieure. En fin de compte, la mesure microscopique et l’immunochimie de la sphère neurologique résultante.

Les cultures sont utilisées pour mettre en évidence les changements dans la sphère neurologique, l’expansion de la population et le choix du destin cellulaire en réponse à la baisse de l’exposition à l’oxygène, respectivement. L’étalonnage du système est essentiel lors de l’exécution de cette technique. La vérification des connexions de configuration appropriées et des débits des instruments est essentielle à la bonne administration du gaz, à l’exposition intermittente à l’hypoxie et à la sécurité de l’animal.

Avant de commencer la procédure, faites passer un morceau de tube en plastique d’un huitième de pouce de diamètre à partir du débitmètre des réservoirs d’air comprimé contenant le gaz de référence à 21 % et le gaz de défi à 10 % ou le gaz d’hypoxie à un débitmètre. Puis à un régulateur de débit biaisé, permettant des débits d’un litre par minute vers chaque chambre. Faites passer des tubes de la même taille du régulateur de débit de polarisation aux chambres de pléthysmographie et scellez toutes les connexions inutilisées vers et depuis l’unité de flux de polarisation et toutes les ouvertures inutilisées vers les chambres afin qu’aucun flux de gaz ne s’échappe.

Placez ensuite les chambres dans un incubateur pour l’équilibrage à 34 à 37 degrés Celsius afin de calibrer les temps de cycle. Tout d’abord, vérifiez que tous les tubes sont correctement connectés entre les réservoirs de gaz et le reste de l’équipement. Connectez ensuite un capteur d’oxygène ambiant à son oxygénomètre portable correspondant et fixez le capteur au couvercle de la chambre de pléthysmographie.

Ouvrez les deux réservoirs de gaz et fixez le flux de gaz hors cycle avec une paire d’hémostats chirurgicaux à long manche isolés par des tubes en plastique de sorte qu’un seul type de gaz soit délivré aux chambres à la fois. Enregistrez ensuite le temps nécessaire pour que l’oxygène de la chambre atteigne le niveau cible de 10 % et revienne à 21 %Après avoir vérifié que tous les tubes sont correctement connectés, placez les nouveau-nés dans la chambre de pléthysmographie et logez les couvercles de la chambre de pléthysmographie dans la base de la chambre. Confirmez la bonne fermeture du joint torique ainsi que la fermeture de tous les raccords de chambre inutilisés pour assurer la distribution appropriée des mélanges de gaz.

Et puis placez les chambres contenant les chiots à traiter dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Laissez la chambre et les petits s’équilibrer à 37 degrés Celsius à l’oxygénation de l’air ambiant. Ouvrez ensuite les deux réservoirs de gaz et utilisez une paire d’hémostatiques pour fixer le débit de gaz du cycle d’arrêt, comme cela vient d’être démontré.

À l’aide d’une minuterie portable, chronométrez précisément les cycles en indiquant le temps de commutation des hémostats entre les tubes pour alterner le flux de gaz vers les chambres. Consigner la fin de chaque cycle à l’aide d’un registre de traitement. Surveillance de la température de l’incubateur à chaque cycle.

Changement pour s’assurer que les animaux sont maintenus dans le champ de tir désigné. Surveillez de près l’activité des petits rongeurs tout au long du protocole pour vous assurer que les animaux tolèrent les cycles sans détresse visible. Pour isoler les cellules formant la neurosphère, retirez les petits de la chambre immédiatement après la fin de l’hypoxie intermittente et récoltez le tissu de la zone sous-ventriculaire dans les 30 minutes.

Enfin, ajoutez le tissu à la culture de la neurosphère et effectuez le passage et l’expansion standard pour les neurosphères dérivées. Après une hypoxie intermittente, l’administration vient de mettre en évidence des populations de cellules neurales, souches et progénitrices dérivées de la zone sous-ventriculaire cultivées sous forme de neurosphères pendant 14 jours. Présenter une augmentation de diamètre de près de deux fois, démontrant une expansion accrue à l’intérieur de chaque sphère en formation.

D’autres cellules qui sont plaquées dans des conditions permissives, par exemple, en l’absence de facteurs mitogéniques, produisent significativement plus de cellules bêta-trois tubulines positives, indiquant une différenciation neuronale plus étendue par rapport aux cellules prélevées sur des chiots témoins traités normoxiques. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la récolte et la culture de cellules souches peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le comportement des cellules neurales après une exposition intermittente à l’hypoxie.