Mesure de larves activité dans le Drosophila Moniteur d'activité

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’activité larvaire sans utiliser de logiciel d’analyse vidéo compliqué. Pour ce faire, les larves sélectionnées sont d’abord transférées dans un filtre à mailles afin d’éliminer les débris. Ensuite, les larves individuelles sont transférées dans des tubes d’essai où elles sont fixées par des bouchons de tarière, qui sont insérés dans un moniteur d’activité de la drosophile ou un dispositif de barrage.

Après trois à cinq minutes d’acclimatation, des enregistrements sont prélevés à partir du système DAM pour analyse. En fin de compte, les mouvements larvaires mesurés par le barrage peuvent être utilisés pour analyser différents paramètres d’activité pour un génotype donné. L’un des avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle est automatisée et objective.

Bien qu’il soit assez simple pour les mesures d’activité de routine, de nombreux laboratoires disposent déjà de l’équipement nécessaire qui peut être facilement adapté pour une utilisation sur des larves. Aiden McFarlin, un étudiant de premier cycle de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Ce protocole utilise un dispositif de surveillance de l’activité de la drosophile à cinq faisceaux multiples ou une digre.

Pour mettre en place le barrage. Tout d’abord, connectez le moniteur à l’unité d’interface d’alimentation ou au PSIU à l’aide d’un câble téléphonique CAB six. Branchez ensuite le PSIU à une prise de courant.

Un voyant vert indiquera une connexion appropriée. Troisièmement, connectez le PSIU via un câble USB à un ordinateur pour l’enregistrement des données. Installez et ouvrez maintenant le programme du système DAM MB one V six X sur l’ordinateur.

Lorsque le logiciel est ouvert, il commence automatiquement à enregistrer les données dans la commande logicielle. Pour le barrage, réglez l’intervalle d’enregistrement souhaité. Choisissez vos préférences, puis cliquez au-dessus ou en dessous de l’option d’intervalle de lecture pour sélectionner différentes périodes dans lesquelles les données seront stockées.

Il existe une variété d’autres paramètres qui peuvent être définis dans les préférences et sous le type de données de sortie. Chaque paramètre fournit une analyse unique de l’activité larvaire à l’intérieur du tube. Il est suggéré de sélectionner tous les paramètres avant la collecte des données.

Si vous n’êtes pas certain du paramètre que vous souhaitez mesurer Pour cet essai, préparez un flacon avec des larves en quête de nourriture Pour chaque génotype destiné à être testé. Utilisez un environnement standard et de la nourriture pour mouches pour préparer les tubes de dosage. Versez une solution à 4 % de vis sans fin à une profondeur de 1,5 cm dans une boîte de Pétri.

Cela devient le matériau du bouchon pour le tube de test, trop dense pour être enfoui. Ensuite, assurez-vous que les tubes sont propres et dégagés en les lavant à l’eau chaude. Ensuite, faites chauffer une bouteille compressible avec 100 millilitres d’eau au micro-ondes pendant 10 à 15 secondes ou jusqu’à ce qu’il y ait de la condensation.

Ensuite, retournez le flacon et pressez doucement l’air chaud et humide dans le tube de dosage. Lorsqu’une fine couche de condensation apparaît sur la paroi du tube, celle-ci est suffisamment humide. Ensuite, retirez le disque de gel du plat et placez-le sur une surface en maille, à laquelle il n’adhérera pas fermement.

Pour recueillir les larves, préparez un filtre à mailles en étirant un treillis en nylon de qualité sérigraphie sur un entonnoir. Fixez le filet au niveau du col de l’entonnoir à l’aide d’un élastique et positionnez l’entonnoir dans un bécher. Maintenant, prélevez une spatule pleine de nourriture contenant des larves butineuses de la bouteille de culture et transférez-les dans le filtre à mailles.

Lavez la nourriture des larves à température ambiante, à l’eau du robinet, les larves individuelles peuvent être collectées sur le grillage à l’aide d’un pinceau. Transférez les larves sur environ 1,5 pouce dans un tube de dosage humide. Scellez ensuite le tube en le bouchant avec une vis sans fin.

Cela se fait en appuyant deux fois sur une extrémité du tube dans le gel et sur l’autre extrémité. Une fois que la pression force l’un des deux bouchons à l’extrémité opposée, au fur et à mesure que les tubes sont chargés, placez-les dans le barrage. Ensuite, ajustez la position de chaque tube afin que l’animal ne puisse pas se déplacer au-delà de la portée des capteurs.

Fixez ensuite les tubes à l’appareil à l’aide d’un anneau de mastic. Enregistrez l’activité des LARVES dans un incubateur à 20 degrés Celsius afin d’éviter les lectures inexactes qui peuvent survenir en raison des ombres, des lumières fluorescentes ou des variations de température en laboratoire. Dans l’incubateur.

Utilisez un éclairage LED non fluorescent pendant l’enregistrement. Avant de recueillir des données, laissez les larves s’acclimater pendant cinq minutes. Il peut être utile d’effectuer un essai sans aucun animal pour s’assurer que les conditions de lumière ne déclenchent pas les capteurs DAM.

Au bout de cinq minutes, démarrez le logiciel DAM préconfiguré pour lancer l’enregistrement. Le test peut durer 30 minutes sans condensation supplémentaire ni nourriture. Il est essentiel qu’avant l’enregistrement, le paramètre d’activité destiné à l’analyse ait été sélectionné dans les préférences.

Si elle n’est pas sélectionnée, cette activité ne sera pas disponible pour l’analyse post hoc. Une fois la durée d’enregistrement souhaitée terminée, fermez le logiciel DAM, les données sont automatiquement enregistrées dans le dossier de données du système DAM. Transférez le fichier de données dans un dossier séparé afin qu’il puisse être traité ultérieurement.

Les tubes de dosage peuvent être nettoyés à l’eau bouillante pour être réutilisés. Pour traiter les données brutes dans un format compréhensible, ouvrez l’application d’analyse de fichiers DAM et choisissez. Sélectionnez le dossier de données d’entrée, puis choisissez le dossier de données et le fichier souhaité et sélectionnez l’option d’analyse.

Enfin, sélectionnez la longueur du bac en fonction de la période de lecture souhaitée. Cela organise les données brutes en paramètres définis par l’opérateur. Sélectionnez maintenant le type de données de sortie pour analyser le paramètre de mouvement souhaité.

Si la longueur du bac est supérieure à l’intervalle de lecture du système sélectionné, allez dans le menu des lectures supplémentaires et sélectionnez l’option deux Somme dans les groupes. Ensuite, enregistrez le fichier sous un nom approprié dans le même dossier que celui dans lequel les données brutes ont été transférées. À l’aide d’un tableur standard, ouvrez le fichier enregistré.

Selon le type de données analysées, la feuille de calcul doit être lue différemment. En règle générale, pour mesurer les mouvements ou les comptages, la période de l’étude sera enregistrée numériquement tandis que chaque tube de lecture recevra une lettre désignée. Normalement, les colonnes K à Z représentent les emplacements pour les tubes d’essai, et les lignes représentent les points de données collectés.

Si, par exemple, les mouvements ont été collectés pendant 20 minutes, en une minute, les intervalles font la moyenne des 20 rangées pour calculer un nombre moyen de mouvements par minute et d’autres mesures. Une étude de la réponse à la température des larves du troisième stade de la souche W 1 1 1 8 a été réalisée à l’aide du dispositif de surveillance pour détecter les différences de locomotion des larves. À sept températures différentes, chaque larve a été analysée pendant 20 minutes.

De toute évidence, les larves sont devenues beaucoup plus actives à mesure que l’environnement se réchauffait. À titre de comparaison, un mutant hypoactif de la souche W 1 1 18 a été testé appelé inactif. L’analyse a révélé que les larves inactives étaient significativement moins mobiles qu’un témoin pour tester les limites de détection de l’essai.

Une comparaison des larves à différents stades a été faite alors qu’elles étaient beaucoup plus petites que la troisième chez les larves étoilées. L’activité de la première et de la deuxième chez les larves d’étoiles était en effet détectable et mesurable en examinant les changements d’activité avec le temps passé dans le dispositif. Il a été constaté que l’activité de third chez les larves d’étoiles à chaque minute de l’essai de 20 minutes est demeurée relativement constante.

Une fois maîtrisé, ce protocole fournit une méthode précise, simple et rentable pour évaluer les paramètres de base de l’activité larvaire dans diverses conditions expérimentales.