Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l'ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’utilisation de techniques standard pour quantifier la colonisation du cancer de l’ovaire par les dépôts adipeux péritonéaux. Ceci est accompli par l’injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses de l’ovaire dans des souris après le sacrifice des souris à des moments spécifiques. Les dépôts de graisse péritonéale sont identifiés et isolés chez les souris.

Enfin, le nombre de cellules cancéreuses de l’ovaire présentes dans des dépôts adipeux spécifiques est quantifié par cytométrie en flux. De plus, pour les études basées sur les mécanismes, la colonisation des cellules cancéreuses de l’ovaire peut également être étudiée en co-culture ex vivo, suivie d’analyses quantitatives et/ou moléculaires appropriées. In fine, ces approches in vivo et ex vivo permettent d’interroger les processus impliqués dans la colonisation des cellules cancéreuses de l’ovaire du tissu adipeux péritonéal via des méthodes qualitatives ou quantitatives.

Le principal avantage de cette approche est que nous sommes en mesure de mettre en œuvre des techniques standard pour évaluer des étapes spécifiques dans la colonisation métastatique du tissu adipeux péritonéal. Les implications de la technique étendent la prévention des métastases. Plus précisément, il permet d’identifier les interactions entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement qui régulent la croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire dans des structures contenant des cellules immunitaires appelées taches laiteuses.

En général, les personnes novices dans cette méthode trouveront utile d’avoir de l’expérience dans la manipulation des souris. Bien que les injections intrapéritonéales semblent simples, l’absence d’une bonne technique peut conduire à des données inexactes. De plus, la dissociation des tissus en suspension unicellulaire nécessite de la pratique et une planification méticuleuse avant le début de l’expérience.

Cette technique particulière ne nécessite pas que les animaux soient sous anesthésie. Selon les protocoles approuvés, effectuez cette technique sur des animaux vivants. Chargez 500 microlitres de suspension unicellulaire marquée par fluorescence dans la seringue.

Ensuite, insérez la seringue dans une aiguille stérile de calibre 25 pour réduire le cisaillement cellulaire avant l’injection. En retenant la souris avec l’autre main, saisissez la souris par la peau du cou et tenez la queue à l’aide de la paume et de l’index. Fixez ensuite la patte arrière gauche entre l’annulaire et l’auriculaire pour éviter de traumatiser les organes abdominaux.

Retenez bien la souris afin qu’elle ne puisse pas bouger pendant l’injection. Imaginez une ligne sur l’abdomen et localisez un point sur le côté droit de l’animal et près de la ligne médiane. Le point d’entrée est crânien deux et légèrement médial du dernier mamelon.

Préparez-vous à insérer l’aiguille sur le côté droit de la souris pour éviter le cæcum et réduire le risque de perforation des intestins. Insérez l’aiguille dans la région latérale inférieure de l’abdomen de la souris à une profondeur d’environ 0,5 centimètre. Tirez sur le piston pour confirmer que l’aiguille n’a pas pénétré un vaisseau sanguin ou d’autres organes péritonéaux.

Si aucun liquide n’est aspiré, injectez l’échantillon en utilisant une pression lente et régulière. Retirez ensuite l’aiguille et remettez la souris dans sa cage. Ne pas remettre la seringue avant de la jeter dans le récipient pour objets tranchants.

Sacrifiez les souris à des moments précis après l’injection pour l’ablation d’organes vitaux. Comme décrit dans le protocole textuel, la récolte de dépôts de graisse péritonéale constitue l’ablation d’organes internes. Faites une incision médiane près de la bouche inguinale à travers la paroi péritonéale pour exposer les organes internes afin d’exciser la graisse omentale.

Exposez le complexe pancréatique omental en étendant la rate de la cavité péritonéale avec des pinces pour la graisse gonadique. Utilisez des pinces pour soulever la graisse gonadique entourant les ovaires et excisez-la en coupant les connexions tissulaires. Immédiatement. Placez les mouchoirs dans du PBS glacé.

Ensuite, retirez la graisse utérine à l’aide d’une pince pour soulever la graisse utérine entourant les cornes utérines et excisez en coupant les connexions tissulaires avant de placer immédiatement les tissus dans du PBS glacé. Lors de l’obtention de la graisse mésentérique, coupez la jonction entre l’intestin grêle et le pylore. À l’aide d’une pince, saisissez fermement l’extrémité libre de l’intestin grêle et retirez-la lentement de la graisse mésentérique.

Libérez la graisse mésentérique de la racine mésentérique à l’aide de ciseaux de dissection. Ensuite, placez immédiatement les mouchoirs dans du PBS glacé. Enfin, pour éliminer la graisse portale pléo, soulevez l’extrémité distale de la rate à l’aide d’une pince pour exposer la fine bande graisseuse de tissu, reliant le hile de la rate au pancréas.

Excise la graisse porte pléo en la libérant d’abord du pancréas, puis en la disséquant soigneusement de la rate. Ensuite, placez immédiatement les tissus dans le PBS pour commencer à peser. Associez tous les tissus adipeux à l’épiploon.

Transférez les tissus dans des tubes séparés de cinq millilitres contenant 1,5 millilitre d’ECCO sans sérum, de milieu d’aigle modifié ou DMEM et 0,1 % d’albumine sérique bovine. Regrouper les tissus récoltés sur trois souris indépendantes afin d’assurer un rendement suffisant en cellules pour la cytométrie en flux. Ensuite, hachez les tissus à l’aide de ciseaux chirurgicaux et ajoutez 1,5 millilitre de DMEM sans sérum contenant 0,4 % de collagénase.

Incuber la suspension tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un mélange rotatif en option. Dissocier davantage le tissu par mastication. Dans ce cas, transférez la suspension de collagénase tissulaire dans un micro-estomac ou un sac et mâchez pendant 10 minutes à basse température, en tournant l’orientation des sacs après cinq minutes.

Ensuite, filtrez les échantillons à travers un filtre à mailles en nylon pour éliminer les gros débris. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter la fraction surnageante. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de PBS combiné à 900 microlitres de chlorure d’ammonium, de lyse potassique, de tampon et incubez à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules comme auparavant et jetez le surnageant après la réanimation, en suspendant la pastille cellulaire dans 250 microlitres de PBS glacé pour filtrer les échantillons à travers une maille de nylon de 60 microns pour assurer une suspension à cellule unique. Ensuite, rincez le filtre avec 250 microlitres de PBS de culture glacé et préparez des cellules et des réusus marqués par fluorescence. Suspendre à une concentration de 2 millions de cellules par millilitre.

Appliquez environ six microlitres de colle tissulaire sur la membrane de la culture. Insérez-le et laissez-le sécher à l’air. Ensuite, lavez la membrane deux fois à l’eau stérile pour éliminer tout excès d’adhésif Avant de sécher les membranes à l’air libre sous un capot laminaire, exciez soigneusement l’OA et fixez-le à la membrane enduite d’adhésif à l’aide d’une pince stérile.

Après avoir laissé le tissu adhérer à la membrane pendant une minute, ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire sur chaque épiploon dans chaque insert de culture. Remplissez ensuite la zone autour de la chambre de transpuits avec 2,5 millilitres de média DMEF 12. Incuber l’OA avec une suspension cellulaire pendant six heures à 37 degrés Celsius dans un environnement à 5 % de CO2.

Retirez délicatement l’OA et lavez avec environ 10 millilitres de PBS. Enfin, visualisez les foyers des cellules cancéreuses fluorescentes à l’aide d’un système d’imagerie fluorescente approprié. Les emplacements relatifs des dépôts adipeux péritonéaux peuvent être observés via une dissection anatomique macroscopique.

Voici un aperçu plus approfondi du portail Pleo et de l’adipeux omental. Les tailles relatives des dépôts adipeux excisés sont indiquées ici. Des taches laiteuses sont observées dans l’omental et le pléo porte adipeux à l’aide de l’histologie standard.

Les résultats quantitatifs de l’analyse de l’écoulement de divers dépôts de graisse péritonéale sont présentés. Les critères de contrôle pour les analyses sont présentés ici. Des cellules parentales idéalisées ont été utilisées comme contrôle négatif.

Les préparations de tissu omental contenaient une population significative de cellules positives pour la tomate TD par rapport à la graisse mésentaire utérine et gonadique. À la cytométrie en flux quantifiée, les données sont exprimées comme l’augmentation moyenne du changement de pli des événements positifs de la tomate TD par rapport aux souris injectées de PBS in vivo et la colonisation ex vivo de l’OA par SKV trois, IP un GFP cellules cancéreuses de l’ovaire est montrée ici. L’imagerie par fluorescence de l’arthrose entière a démontré des schémas de colonisation similaires de la localisation des cellules cancéreuses dans les essais in vivo et ex vivo.

L’examen histologique de ces tissus a confirmé la présence de cellules cancéreuses localisées aux taches laiteuses. Enfin, la détection immunohistochimique de la cytokératine exprimée par SKO V, trois cellules IP et une cellule GFP confirme ces résultats histologiques. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’identifier et d’exciser soigneusement le tissu adipeux péritonéal et d’éviter la contamination par d’autres types de tissus, ce qui faussera ensuite les données quantitatives obtenues par cytométrie en flux.

Deuxième chose, il est important de ne pas oublier de choisir mes variétés appropriées pour l’étude en question. La technique peut être utilisée pour identifier les interactions de lignées cellulaires de cancer de l’ovaire bien établies dans le microenvironnement de l’épiploon qui sont importantes pour la formation de métastases. Il peut également être utilisé pour évaluer le potentiel malin des lignées cellulaires qui modélisent les lésions précoces observées dans les trompes de Fallope.