Isolement et cryoconservation des rats nouveau-nés cardiomyocytes

L’objectif global de cette procédure est de cryopréserver les cardiomyocytes néonatals de rat, puis de décongeler les cellules pour les utiliser dans des études in vitro. Ceci est accompli en hachant le cœur néonatal en petits morceaux. Les cardiomyocytes sont ensuite enzymatiques, dissociés du tissu cardiaque, cryoconservés et finalement décongelés pour une culture cellulaire ultérieure.

En fin de compte, les cellules décongelées peuvent être utilisées pour divers essais in vitro, y compris l’analyse immunofluorescente des marqueurs cardiaques d’intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet de gagner du temps en ne nécessitant pas d’isoler complètement les cardiomyocytes lorsque des cellules sont nécessaires pour un dosage. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les nuances impliquées dans la connaissance de la taille et de la consistance correctes des échantillons pendant les étapes d’isolement et de traitement sont difficiles à apprendre sans démonstration directe.

Une fois que tous les cœurs néonatals ont été prélevés, retirez tout tissu non cardiaque des échantillons et lavez les cœurs avec HBSS et en tourbillonnant doucement. Après un deuxième lavage et une nouvelle plaque, coupez les échantillons en morceaux d’un à trois millimètres cubes et transférez le tissu dans 40 millilitres de voyages froids pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius sur un transat. Le lendemain, confirmez que la trypsine est claire et que le tissu semble duveteux.

Laissez le tissu se déposer au fond du tube et aspirez autant de liquide que possible. Ensuite, à 25 millilitres de NR cm chaud, à moyen avec 10 % FBS dans le tube et faites-le tourner à la main. Placez ensuite le tube dans un bain-marie rotatif à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.

Lorsque le tissu commence à flotter, aspirez le surnageant du fond du tube et, à 10 millilitres de collagénase fraîchement préparée, remettez le tissu dans le bain-marie pendant deux minutes de plus jusqu’à ce que la solution soit trouble. Ensuite, aspirez rapidement le surnageant S et ajoutez 10 millilitres de collagénase fraîche pour une autre incubation rotative. Après les deux dernières minutes, itérez plusieurs fois la boue tissulaire et transférez autant de surnageant que possible dans le premier des cinq tubes de 15 millilitres contenant quatre millilitres de HBSS sur de la glace.

Répétez la digestion jusqu’à ce que chacun des tubes de HBSS contienne du surnageant du tube d’échantillon, puis centrifugez tous les tubes. Ensuite, aspirez le surnageant de chacune des pastilles et remettez en suspension les cellules dans chaque tube avec six millilitres de HBSS. Maintenant, regroupez les cellules à travers une passoire de 40 microns dans un tube conique de 50 millilitres.

Rincez ensuite le côté de chaque tube de 15 millilitres avec trois millilitres de HBSS froid et tirez les lavages dans le tube conique de 50 millilitres. Après avoir fait tourner à nouveau les cellules, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu préchauffé. Transférez ensuite les cellules dans une fiole T 75 avec cinq millilitres de lavage à partir du tube de 50 millilitres et incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

À la fin de l’incubation, transférez les cellules dans une fiole T 1 75 avec 15 millilitres de lavage à partir de la fiole T 75 et incubez les cellules pendant une autre heure. Pour cryoconserver les cellules, aliquote les cellules flottantes de la culture cellulaire dans des tubes coniques de 50 millilitres. Réservez 10 microlitres pour le comptage par exclusion trian blue et faites tourner les cellules pendant la centrifugation, comptez les cellules.

Ensuite, mettez le granulé en suspension dans le milieu de congélation à deux à quatre fois 10 à six cellules par millilitre. Transférez des aliquotes d’un millilitre des cellules dans des flacons cryogéniques et placez les flacons dans un récipient de congélation à vitesse de refroidissement contrôlée, suivi d’un stockage à court terme à moins 80 degrés Celsius dans un délai d’un à deux jours, transférez les flacons dans de l’azote liquide. Quand il est temps de décongeler les cellules.

Enduire d’abord un plat de suffisamment de fibronectine pour couvrir le fond de la plaque de culture et incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Lorsque la plaque est prête, placez les cellules sur de la glace sèche, puis réchauffez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lorsque la suspension cellulaire vient d’être décongelée, lavez immédiatement les cellules par centrifugation quatre fois après le dernier lavage, comptez les cellules viables par exclusion triam blue et remettez la pastille en suspension dans un milieu frais.

Enfin, incubez les cellules sur les boîtes enrobées de fibronectine à la concentration appropriée pour l’analyse. Rafraîchissez le milieu tous les jours pendant une semaine, après quoi les cellules devraient avoir commencé à battre. Généralement, lors de la décongélation, la viabilité des cellules sera entre 40 et 60 %, bien que cela soit inférieur à celui observé pour d’autres types de cellules.

Avec un ensemencement et une culture appropriés, les cellules proliféreront. Dans les trois jours environ suivant la culture, les cellules devraient commencer à se contracter spontanément, ce qui peut être confirmé par la microscopie à contraste de phase. Dans cette expérience représentative, les cellules ont été plaquées dans quatre lames de culture à deux fois 10 à la cinquième cellules par puits marquées avec de l’actine alpha sarcomérique et imagées par microscopie à fluorescence.

De nombreuses cellules positives à l’actine alpha sarcomérique, qui apparaissent ici sous forme de coloration verte, ont été identifiées, confirmant la présence des cardiomyocytes néonatals du rat. D’autres analyses en aval peuvent également être effectuées avec ces cellules. Par exemple, dans cette expérience représentative, les cardiomyocytes néonatals de rat ont été cultivés avec des exosomes dérivés de cellules souches cardiaques humaines pour tester les propriétés régénératrices des vésicules humaines lors de la partie décongélation de cette procédure.

Il est important d’agir rapidement et avec précision pour assurer un rendement cellulaire viable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler avec succès la cryoconservation puis la décongélation des cardiomyocytes néonatals de rat pour une utilisation dans des études in vitro.