Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

Ici, nous présentons un protocole de culture des arcs pharyngiens pour étudier la biologie des cellules progénitrices cardiaques et musculaires et de leur microenvironnement.

L’objectif général de cette procédure est d’étudier le maintien, la migration et le devenir des progéniteurs cardiaques et musculaires dans le mésoderme pharyngé. Ceci est accompli en disséquant d’abord les arcs pharyngiens d’un embryon de souris fraîchement récolté. Ensuite, les arches sont placées dans un film de support pour faciliter leur fixation.

Les cellules à l’intérieur ou migrant de l’explan pharyngé sont ensuite surveillées quotidiennement. En fin de compte, le traçage de la lignée de fluorescence basé sur le cri peut être utilisé pour suivre la migration, la différenciation et le renouvellement des progéniteurs cardiaques et musculaires dans les arcs pharyngés. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit du seul système ex vivo permettant d’étudier in vitro une population renouvelée de progéniteurs cardiaques ou musculaires et leur microenvironnement.

La démonstration de cette méthode est essentielle car les arcs parentaux des embryons de souris âgés de 9,5 jours ne mesurent que deux à 300 micromètres, ce qui les rend très difficiles à identifier et à disséquer sans visualisation préalable. Avant de commencer la procédure. Coda 12, plaque à puits avec PBS complété par 10 % FBS.

Au bout d’une heure, remplacez la solution d’enrobage par 200 microlitres de milieu sans sérum par puits. Tourner la plaque pour s’assurer qu’une pellicule de médium recouvre toute la surface du fond du puits. Ensuite, vaporisez et nettoyez le ventre d’une souris enceinte euthanasiée avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, à l’aide d’outils stériles, faites une incision de 0,5 centimètre au niveau de la région navale. Saisissez la peau au-dessus et en dessous de l’incision et tirez doucement dans des directions opposées. Faites ensuite une incision en forme de V dans la membrane du nombril aux ovaires de chaque côté de l’abdomen pour révéler l’utérus.

Pincez l’oviducte reliant l’utérus à l’ovaire avec des pinces et l’oviducte du côté de l’ovaire avec des ciseaux pour libérer l’utérus de l’ovaire. Tirer doucement l’utérus vers le haut par l’uct. Coupez l’utérus de la région de la vessie.

Ensuite, tirez l’utérus plus haut par l’UCT et coupez l’UCT de l’autre côté, libérant l’utérus de la cavité abdominale. Transférez l’utérus dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS froid et stérile avec du calcium et du magnésium. Secouez doucement le tube pendant 10 secondes pour éliminer le sang.

Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez l’utérus dans une boîte de 10 millilitres et ajoutez cinq millilitres de PBS froid dans le tissu. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope, utilisez deux paires de pinces pour ouvrir doucement l’utérus et disséquer les sacs amniotiques contenant les embryons un par un. Ensuite, pour chaque embryon à tour de rôle, pincez et retirez doucement le sac amniotique avec une paire de pinces en utilisant l’autre paire pour couper et libérer le sac de l’embryon.

Placez l’embryon sur le côté et à l’aide d’une pince pour couper la première et la deuxième arcade postérieurement au cœur, entre l’arcade et la poche pharyngée. Après avoir retourné l’embryon et coupé l’arc de l’autre côté, on vient de le démontrer. Coupez la voie d’écoulement cardiaque reliant les arcades à l’embryon et retirez-les.

Pincez et relâchez chacun des deux arcs pharyngiens de la voie d’écoulement cardiaque restante et des quatre endodermes intestinaux. À leur tour, transférez ensuite les tissus au centre des puits individuels de la plaque à 12 puits revêtue en veillant à ce que les arcs ne soient pas recouverts par le milieu. Pour faciliter la fixation, incubez les arceaux dans des conditions de culture cellulaire.

Après deux heures, ajoutez 200 microlitres de 37 degrés Celsius, sans sérum sur les côtés des puits, en veillant à ce que les arches restent attachées et incubent les tissus pendant la nuit. Le lendemain, il a été visuellement confirmé que les arches sont toujours attachées. Ajoutez ensuite doucement 200 microlitres supplémentaires de milieu sans sérum à 37 degrés Celsius dans les puits.

Si les tissus se détachent et commencent à flotter, retirez doucement le milieu à l’aide d’une pipette sans retirer les arcades jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’une pellicule de support. Ensuite, utilisez la pointe de la pipette pour ramener les arcades au milieu du puits et incuber à nouveau les tissus. Tous les deux jours, remplacez tout milieu évaporé par 100 à 200 microlitres de milieu frais pendant le développement.

Les progéniteurs du muscle facial et du cœur peuvent être suivis au fur et à mesure qu’ils prolifèrent et migrent du premier et du deuxième arc pharyngé pour devenir respectivement la tête et la musculature cardiaque. La culture des arcs pharyngiens offre un moyen unique d’étudier en détail le développement cardiaque et musculaire ex vivo. À l’aide du système de verrouillage CRE, la descendance du mésoderme de souris peut être retracée par des rapporteurs fluorescents sur l’expression Cree dans les 24 à 48 heures suivant la culture ex vivo après 36 à 72 heures.

La formation de cardiomyocytes peut être confirmée visuellement par la contraction spontanée d’amas de cellules migratrices au sein du deuxième arc, ainsi que par l’analyse de marqueurs spécifiques de cardiomyocytes. Après trois à sept jours de culture, la formation du myotube et des muscles faciaux peut être visualisée comme des cellules allongées et à contraction spontanée dans le premier arc, et par l’analyse de marqueurs musculaires spécifiques après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches cardiaques et musculaires pour surveiller et étudier directement les progéniteurs en expansion et leurs niches in vitro.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les arcs foraux des embryons de souris en développement et la culture in vitro, qui permet l’étude du développement pro-génératif du cœur et des muscles, ex vivo.