Name: Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des cellules endothéliales tumorales spécifiques à partir de modèles murins génétiquement modifiés. Cette méthode utilise l'enrichissement magnétique et les anneaux de clonage pour obtenir des populations pures et viables.

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ACD est soutenu par une subvention de l’Institut National de la Santé (R01-CA177875). LX est membre du programme de médecine translationnelle financé par HHMI à l’UNC Chapel Hill. JVM est soutenu par une bourse pré-doctorale T32 du programme de biologie vasculaire intégrative de l’UNC Chapel Hill. Nous remercions Clayton Davis pour son aide avec la microscopie confocale.

Le protocole suivant est effectué conformément aux lignes directrices établies par le ministère de médecine de laboratoire vétérinaire de l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. 1. Préparer le matériel suivant et réactifs Avant de partir <ol><li> Préparer les médias CE en la complétant 400 ml faible taux de glucose (1 g / L D-glucose ou LG) modifié par Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec 50 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur, 50 ml Nu-Sérum IV, 5 ml antibiotique-antimycosique, et le hFGF, le VEGF, le hEGF, R3-IGF-1, et des composants de l&#39;héparine à partir du kit commercial. </li><li> Préparer 500 ml FACS tampon (0,5% de BSA et 2 mM d&#39;EDTA dans du PBS); filtrer à travers un filtre de 0,22 um tasse stérile. </li><li> Stériliser ou désinfecter conseil dissection. </li><li> Stériliser les repères de dissection, ciseaux chirurgicaux, et dissecteurs. </li></ol> 2. Isolement CE (Jour 1, ~ 5 h) <ol><li> Euthanasier la souris avec du dioxyde de carbone ou d&#39;autres méthodes d&#39;esprit conformeh Comité des soins et de l&#39;utilisation des animaux institutionnel (IACUC) politiques. Remarque: tumeurs mammaires multiples de taille variable (5 - 15 mm de diamètre) peuvent se développer en une seule souris génétiquement modifiée comme C3-Tag, assurez-vous de les récolter tous pour l&#39;isolement du TEC. Si vous utilisez des tumeurs qui sont orthotopiquement greffées chez la souris, la piscine deux à trois 1 cm 3 tumeurs pour un seul isolement CE. Ici, nous utilisons des tumeurs mammaires comme une démonstration, mais le protocole peut être modifié pour d&#39;autres types de tumeurs. </li><li> Désinfecter souris par pulvérisation ou essuyage de la face ventrale de souris avec une quantité abondante de 75% v / v d&#39;éthanol. </li><li> Réséquer tumeurs avec une paire de ciseaux et ciseaux à l&#39;aide de techniques aseptiques sous une hotte stérile ou à un banc propre. <ol><li> Allongez-vous et épinglez les membres de la souris sur une planche de dissection. Faire une incision médiane ventrale avec les ciseaux sans ouvrir le péritoine. Disséquer latéralement entre la peau et le péritoine vers les glandes mammaires où se trouvent les tumeurs.Ne pas ouvrir le péritoine. </li><li> Accise uniquement de tissu tumoral à partir des glandes mammaires, en laissant de côté les marges mammaires normales. Soigneusement couper les tissus non tumoraux tels que la peau et les muscles, et de placer les tumeurs disséquées dans un tube conique contenant 30 ml de DMEM-LG sur la glace. </li></ol></li><li> Apportez des échantillons de tumeurs à la culture de tissus hotte; laver avec les tissus stériles LG-DMEM 1 - 2 fois. </li><li> Tumeurs de transfert du tube conique à une boîte de Pétri de culture de tissu stérile, ajouter 2 ml de DMEM-LG dans le plat, et mâchent avec une paire de ciseaux stériles en morceaux &lt;5 mm. </li><li> Ajouter 5 ml de la collagénase (Stock = 2 mg / ml dans une solution saline équilibrée de Hank, ci-après HBSS), 1 ml de dispase (stocks = 2,5 U / ml dans HBSS) et 75 ul de désoxyribonucléase (Stock = 1 mg / ml dans PBS ) dans la boîte de Pétri. Le volume total est maintenant ~ 10 ml. </li><li> Transférer le mélange collagénase / tissu de la boîte de Pétri à un tube de tissu-dissociateur et courir sur un dissociateur de tissu pendant 60 secondes deux fois (pré-réglé dissociation prOgram sur le dissociateur: 1.270 tours au total par cycle). Incuber avec la lumière secouant sur un agitateur pendant 75 min à 37 ° C. </li><li> Filtrer à travers un tissu digéré cellule tamis 100 pm sur un tube conique de 50 ml. Le rinçage du filtre avec 5 ml de tampon FACS pour laver toutes les cellules restantes. Spin à 280 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot cellulaire. </li><li> Diluer 1 ml d&#39;actions RBC tampon de lyse (10x) dans 9 ml d&#39;eau stérile. Lyse des globules rouges avec 10 ml de tampon de lyse (1x), et immédiatement tourner 5 min à 280 x g. Remarque: Cette étape peut être ignorée si peu de sang est visible. </li><li> Remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS. Mélanger 10 pi de suspension cellulaire avec 10 pi de bleu trypan, et compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Reprendre cellules à ~ 10 7 cellules / 100 pi. Ajouter 10 ul de bloc FcR pour 100 ul de suspension de cellules, et on incube sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Ajouter anticorps CD31 de rat anti-souris conjugué à PE selon. Tableau 1 incuber sur de la glace pendant 10 - 15 min et le tube de film de temps en temps. </li><li> Ajouter 10 ml de tampon FACS pour le tube et centrifuger à 280 g pendant 5 min. Retirer délicatement le surnageant et laver le culot cellulaire à nouveau avec 5 ml de tampon FACS. Centrifuger pour culotter les cellules. Aspirer le surnageant sans culot cellulaire inquiétante. </li><li> Ajouter tampon FACS et des microbilles anti-PE conformément au Tableau 2 incuber sur de la glace pendant 10 -. 15 min. Tube de Flick occasionnellement. </li><li> Ajouter 10 ml de tampon et des échantillons de rotation FACS à 280 xg pendant 5 min; laver une fois avec 5 ml de tampon FACS et centrifuger à nouveau. Aspirer le surnageant sans culot inquiétante. </li><li> Amener le volume à 300 pi dans du tampon FACS. Spin à 35 um cellule crépine plafonné tube 5 min à 280 x g. Utilisez 2 tubes et un plus grand volume si nécessaire. </li><li> Mettre en place Multistand magnétique et colonnes magnétiques dans le capot, joindre une colonne pour le séparateur et équilibrer la colonne avec 2 ml de tampon FACS. </li><li> Aspirate le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 0,5 - 1 ml de tampon FACS. </li><li> Passez la suspension de cellules à travers la colonne magnétique équilibrée. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 2 ml de tampon FACS, et recueillir écoulement (FT) dans un tube de 15 ml (fraction FT). </li><li> Prendre la colonne hors du séparateur et on élue avec 2 ml de tampon FACS dans un autre tube de 15 ml (fraction d&#39;éluat). Utilisez piston pour assurer que toutes les cellules sont de la colonne. Répéter l&#39;élution deux fois avec 2 ml de tampon FACS à chaque fois. </li><li> Spin l&#39;éluat à 280 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de médias CE. </li><li> Tout aussi diviser la fraction d&#39;éluat (~ 6 ml) dans des boîtes revêtues de gélatine 10 cm. Pour trois de 1 cm 3 tumeurs, plaque cellules élue dans au moins quatre plaques. Cellules variante, la plaque est éluée à des concentrations différentes dans plusieurs plaques (par ex., 0,5 ml, ensemencer 1 ml, 1,5 ml et 3 ml de l&#39;éluat en quatre plaques) veiller à ce qu&#39;unt moins une plaque est peu ensemencé avec des cellules élues. Vérifiez que la confluence des cellules attachées est à ~ 1% le lendemain (soit environ 1,0 - 2,0 x 10 5 cellules attachées). Remarque: Les cellules doivent être plaqué rares de sorte que les colonies CE peuvent former sans être contaminés par d&#39;autres types de cellules. </li><li> Plate fraction FT dans un plat de 10 cm pour laisser les cellules récupérer O / N. Vérifiez que la plaque est 80 - 100% de confluence le lendemain. Congeler bas les cellules (-80 ° C) dans 250 médias congélation de cellules-ul dans un cryotube et rangez-les dans de l&#39;azote liquide le lendemain. Remarque: fraction FT peut être utilisé pour l&#39;isolement de cellules de tumeur à un stade ultérieur et / ou en tant que témoin négatif pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes clones CE CE de isolées. </li><li> Changer de support tous les 2 - 3 jours. Colonies commencent à se former après 7 - 10 jours. Petites colonies CE peuvent être identifiés dès le jour 3. Marquez les colonies avec un marqueur à pointe fine sur le fond du plat. </li><li> Grattez c non spécifiqueaunes entourant les colonies identifiées avec une pointe de Pippet 200 pi stérile. </li></ol> 3. Colony sélection Anneaux Utilisation de clonage <ol><li> Changer de support tous les 2 - 3 jours. CE pureté peut être vérifiée par les LDL (Dil-Ac-LDL) plus à environ 5 - 7 jours. Ajouter 50 pi de LDL par 10 ml de milieu CE et incuber pendant 3 - 4 heures avant de vérifier les cellules sous un microscope à fluorescence. Remarque: LDL Multiple + clones CE pourraient être observés à ~ 7 jours. </li><li> Lancer la récolte des colonies CE quand ils atteignent un diamètre de 3 - 5 mm. (Choisissez grandes colonies qui sont emballés avec les petites LDL + cellules pour de meilleurs résultats.) </li><li> Avant la récolte CE avec des anneaux de clonage, de pré-couche de quelques plaques de 6 puits avec 0,5% de gélatine. Aspirer la gélatine, ajouter 2 ml de milieu CE à chaque puits, et de garder les plaques dans un incubateur jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Grattez non-CE sur les bords des colonies pour vous assurer que pas d&#39;autres types de cellules seront piégés dans le cycle de clonage. </li><li> Utilisation d&#39;unmicroscope à contraste de phase (4X ou 10X objectif), contour avec un marqueur à pointe fine sur le fond de la boîte de culture les zones contenant des colonies de la CE. </li><li> Laver la plaque avec 10 ml de PBS et de laisser une très fine couche de PBS dans la plaque lors de l&#39;aspiration. (Important: une petite quantité (~ 0,5 ml) de PBS va garder les cellules vivantes au cours de la procédure de clonage torique; aussi, tissu adhésif a besoin d&#39;eau pour coller.) </li><li> Choisissez un anneau de clonage de taille appropriée. Utilisez une paire de pince à disséquer pour ramasser une bague, et avec une pipette de 10 pi appliquer uniformément une petite quantité de tissu adhésif sur l&#39;anneau de clonage. Remarque: Utilisez uniquement quantité minimale (~ 0,2 pi pour un petit anneau) d&#39;adhésif de tissu sur des anneaux de clonage, et assurez-vous colle tissulaire est répartie uniformément autour de la surface de fond pour assurer une bonne étanchéité. Adhésif tissulaire excessive produit de la chaleur et fait des films qui peuvent tuer les cellules. </li><li> Placez l&#39;anneau de clonage sur la colonie CE. Appuyez doucement l&#39;anneau de clonage pour coller les ring sur la plaque. Veiller à ce que les colonies ne sont pas séchés avant le collage de la bague. </li><li> Immédiatement pipette 25 pi de solution enzymatique de détachement cellulaire dans l&#39;anneau de clonage et incuber ~ 1 min ou jusqu&#39;à ce que les cellules sont mal fixés. </li><li> Pipet cellules dans l&#39;anneau de clonage goutte à goutte dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits contenant les médias communautaires préchauffées. (Important: Ne secouez pas la plaque pour disperser les cellules; CE préfèrent poussent en grappes serrées.) Lavez la bague de clonage avec 50 - 100 médias communautaires ul de collecter autant de cellules que possible, et de transférer tous les lavages dans le même 6 puits . </li><li> Si certaines colonies dans la boîte de 10 cm sont trop petits pour récolter, ajouter 10 ml de milieu frais, laisser les colonies pousser pendant quelques jours de plus, et de répéter la procédure d&#39;anneau de clonage. </li><li> Poussent des colonies récoltées dans des plaques 6 puits jusqu&#39;à 80 - 100% de confluence, et le transfert des cellules à 3 puits d&#39;une plaque à 6 puits, avant de les étendre dans une boîte de culture de tissu de 10 cm. Grattez cellules contaminantes. Répéterune autre série de la procédure de l&#39;anneau de clonage (étapes 03/05 au 03/10), si nécessaire. Gardez cellules relativement confluentes (~ 60 - 70%) lors de l&#39;expansion. CE peut cesser de croître si plaqué trop clairsemée. </li><li> Caractériser CE par FACS, la coloration, PCR, etc. Notez que Dil-Ac-LDL est fluorescent et peut interférer avec PE ou d&#39;autres anticorps fluorescents pour FACS. </li></ol>

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<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).</li>
<li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1+deficiency+induces+endothelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition.</a> EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+endothelial+cells+with+distinct+patterns+of+TGF%CE%B2-driven+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
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<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+clonally+expanding+haematopoietic+compartment+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow.</a> EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).</li>
<li>Sawamiphak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+regulates+VEGFR2+function+in+developmental+and+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).</li>
<li>Chi, J. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+diversity+revealed+by+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison des difficultés à obtenir des cultures de TEC primaires pures, dont beaucoup dans des études in vitro TEC substitut avec des lignes disponibles dans le commerce de la CE ou primaire CE tels que la veine ombilicale humaine CE (HUVEC) 13. Cependant, ces populations CE de tissus normaux ne peuvent servir de proxy pour les TEC qui diffèrent sensiblement de leurs homologues normales. Par exemple, TEC sont phénotypiquement et fonctionnellement anormale in vivo et certains de ces anomalie...

Les cellules endothéliales (CE) sont essentiels lors du développement de tumeurs solides. De l&#39;initiation du switch angiogénique dans les tumeurs dormantes à la diffusion et l&#39;ensemencement des métastases à des sites distants, CE former les conduits qui fournissent du sang, de l&#39;oxygène et de nutriments pour soutenir la croissance de la tumeur 1. Comme suggéré récemment, EC ont aussi des fonctions de perfusion indépendantes et former une niche qui prend en charge la croissance des cellules souches cancéreuses et d&#39;autres cellules du stroma de la tumeur 2-5. Ainsi, hautement purifié CE (TCE) pour la culture in vitro spécifique de la tumeur permet études fonctionnelles de routine qui va faire la lumière sur les mécanismes moléculaires de médiation angiogenèse tumorale et la diaphonie avec des cellules tumorales. CE sont très spécialisés en fonction du tissu d&#39;origine 6. En raison de la nature hétérogène de différents types de tumeurs et le microenvironnement de la tumeur, TEC peut également afficher des caractéristiques uniques qui reflètent une tumeur spécifique à la spécialisation of le système vasculaire. Par exemple, il existe une variabilité frappante dans les signatures d&#39;expression génique dans TEC isolés à partir de différents types ou classes de tumeurs 7,8. Toutefois, fréquemment co-purification de non-CE, en particulier les fibroblastes associés à une tumeur et les cellules tumorales, avec TEC peut confondre analyses d&#39;expression du génome entier. Ces types de cellules non désirées sont particulièrement problématiques dans les études qui reposent sur ​​le long terme dans l&#39;expansion in vitro de cultures de TEC. Décrit ici est un procédé haute-fidélité qui produit toujours des cultures pures CE de tumeurs et d&#39;autres tissus. Suite à l&#39;enrichissement immunomagnétique des fractions de la CE et l&#39;élimination des co-purifié non-CE colonne, une étape clonage torique supplémentaire pour capturer colonies CE pur est utilisé 9. Chaque colonie peut être étendue en culture pendant plusieurs passages sans l&#39;émergence de contamination non-CE. Cette méthode donne également de multiples clones CE d&#39;une procédure d&#39;isolement unique, ce qui est idéal pour l&#39;étude de l&#39;endohétérogénéité épithélial. En outre, il est démontré que Cdh5 CRE: les souris rapporteurs / l de ZsGreen l / sont un outil précieux pour générer CE &quot;de sort-mappé&quot; et indélébile marqué qui maintiennent ZsGreen fluorescence dans la culture 10. Avec quelques ajustements mineurs au protocole, cette méthode devrait être adaptable à différents types de tumeurs ou de tissus normaux.

<table><tbody><tr><td>Antibiotique-Antimycosique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (1 g/L de D-glucose) (LG-DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Bullet Kit&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td>Tous les composants n’ont pas été utilisés</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin (Hyclone)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Chaleur inactivée à 56 &deg ; C pour 30 min</td></tr><tr><td>Nu-Serum IV</td><td>Corning</td><td>CB-51004</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBBS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>0,5 % BSA et 2 mM EDTA dans le PBS, filtrés par un 0,22 &mu ; Filtre m</td></tr><tr><td>75 % v/v éthanol pour la</td><td></td><td></td><td></td>désinfection</tr><tr><td>Microbilles anti-PE&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) fraction V, 7,5</td> %<td>Gibco</td><td>15260-37</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation cellulaire (Bambanker)</td><td>Wako Chemicals</td><td>302-14681</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td>Augmenter la concentration de stock de 2 mg/ml dans HBSS</td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I (DNase)</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS002004</td><td>Augmenter la concentration de stock de 1 mg/ml dans PBS</td></tr><tr><td>Dil-Ac-LDL</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CL</td><td></td></tr><tr><td>Solution enzymatique de détachement de cellules (Accutase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine, 2 % dans l’eau, qualité culture tissulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ML</td><td>Diluer dans du PBS pour obtenir une solution de gélatine à 0,5 %</td></tr><tr><td>Souris FcR Réactif bloquant&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Protéase neutre (Dispase)</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LS02104</td><td>Concentration de base 2,5 U/ml dans HBSS</td></tr><tr><td>PE-rat anti-souris Anticorps CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges (BD Pharm Lyse)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>stérile</tr><tr><td>Trypan blue, 0,4 %&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire 10 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes coniques (stériles)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes coniques (stériles)&nbsp ;</td><td>Plaques</td> de culture tissulaire Corning <td></td><td></td></tr><tr><td>à 6 puits</td><td></td> Tubes de dissociation tissulaire Corning <td></td><td></td></tr><tr><td>(tubes C SoftMACS)&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de cellules&nbsp ; (MidiMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 100 &mu ; m&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Anneaux de clonage (tailles assorties)</td><td>Bel-Art Products</td><td>378470000</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carte</td><td></td><td></td> de dissection <td>Stériliser ou désinfecter avec de l’éthanol à 75 % v/v avant utilisation&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pinces et ciseaux</td><td></td><td></td> de dissection <td>Stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Broches de dissection 2"</td><td></td><td></td><td>Stériliser avant utilisation&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes FACS avec 35 &mu ; m capuchon filtrant</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Coupelle filtrante (Stericup, 0.22 &mu ; m)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur</td><td></td><td></td><td></td>à pointe fine</tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Multistand magnétique</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Colle tissulaire (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Ou une centrifugeuse d’une capacité similaire pour la centrifugation en tube conique de 15 ml et 50 ml</td></tr><tr><td>Hotte de</td><td></td><td></td><td></td>culture</tr><tr><td>tissulaire Dissociateur tissulaire (gentleMACS)</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Programme prédéfini « m_impTumor_01 » utilisé pour la dissociation tissulaire&nbsp ;</td></tr><tr>Congélateur <td></td><td></td><td></td>à <td>l’azote liquide</td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td><td></td>sur microplaques ou rotatif</tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td> optique à contraste de phase</tr></tbody></table>

isolement et culture expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Fraîchement isolés cellules endothéliales spécifiques de tumeurs (TEC) peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de l&#39;angiogenèse tumorale et servir comme un modèle in vitro pour le développement de nouveaux inhibiteurs de l&#39;angiogenèse pour le cancer. Cependant, à long terme dans l&#39;expansion in vitro des cellules endothéliales murines (CE) est difficile en raison de la dérive phénotypique dans la culture (de transition endothéliale-à-mésenchymateuses) et la contamination avec des non-CE. Cela est particulièrement vrai pour TEC qui sont facilement surpassés par les fibroblastes co-purifié ou des cellules tumorales en culture. Ici, une méthode d&#39;isolement de haute fidélité qui tire parti de l&#39;enrichissement immunomagnétique couplée avec la sélection de la colonie et dans l&#39;expansion in vitro est décrite. Cette approche génère des fractions pures CE qui sont entièrement libres de contaminer les cellules stromales ou tumorales. Il est également démontré que la lignée tracée Cdh5-cre: / l de souris rapporteurs de ZsGreen l /, utilisés avec le protocole décrits ici, sont un outil précieux pour vérifier cellulairela pureté que les colonies isolées CE de ces souris montrent durable et brillante fluorescence ZsGreen dans la culture.

CE représente seulement une fraction mineure de la population cellulaire totale dans la plupart des tissus adultes 11. Il est donc important pour digérer complètement le tissu récolté dans une suspension à cellule unique qui assure la libération maximale de CE à partir de la matrice extracellulaire (ECM) et les tissus conjonctifs. Dans notre expérience, la sélection immunomagnétique CD31 à médiation ne fournit fractions CE enrichis mais pas pures; par conséquent, une autre étape cruciale est l&#39;élimination...

Nous rapportons une méthode fiable pour isoler et cultiver des cellules endothéliales primaires spécifiques à la tumeur à partir de modèles murins génétiquement modifiés.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules endothéliales tumorales à l'aide de colonnes magnétiques et d'anneaux de clonage. Cela est réalisé en premier lieu en digérant le tissu tumoral disséqué chez des souris afin d'obtenir une suspension monocellulaire. La deuxième étape consiste à enrichir la population de cellules endothéliales à l'aide d'une colonne à billes magnétiques.Ensuite, les colonies de cellules endothéliales sont cultivées et sélectionnées à l’aide d’une méthode par anneau de clonage. La dernière étape consiste à amplifier et caractériser les colonies de cellules endothéliales sélectionnées. Enfin, une microscopie en immunofluorescence utilisant des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales est employée pour démontrer la pureté des populations clonales.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le tri de faits, est qu'elle est plus douce pour les cellules, ce qui permet une meilleure récupération de cellules endothéliales viables et une expansion ultérieure des colonies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'angiogenèse tumorale, comme la manière dont le dysfonctionnement des cellules endothéliales vasculaires dans les tumeurs contribue à la progression tumorale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les cellules endothéliales sont fréquemment contaminées par d'autres types cellulaires provenant du microenvironnement tumoral, et il faut donc être rigoureux dans l'élimination rapide de ces cellules contaminantes des cultures après l'euthanasie.Amenez la souris sur un plan de travail propre et désinfectez le côté ventral en pulvérisant une quantité généreuse d'éthanol à 75 % volume pour volume. Ensuite, fixez les membres de la souris sur la planche de dissection en utilisant une technique aseptique appropriée. Pratiquez une incision ventrale médiane sans ouvrir le péritoine, tout en maintenant l'intégrité du péritoine.Diss&eacute;quer lat&eacute;ralement entre la peau et le p&eacute;ritoine en direction des glandes mammaires o&ugrave; se trouvent les tumeurs. Exci&szlig;er uniquement le tissu tumoral des glandes mammaires en &eacute;liminant soigneusement les tissus non tumoraux, notamment la peau et les muscles. Placer les tumeurs diss&eacute;qu&eacute;es dans un tube conique contenant 30 millilitres de milieu DMEM modifi&eacute; de Eagle &agrave; faible teneur en glucose, ou DMEM bas, afin d'initier la dissociation tumorale.Transférez le tissu dans du L-G-D-M-E-M stérile dans une boîte de culture et lavez-le une à deux fois avec du L-G-D-M-E-M. Après les lavages, ajoutez deux millilitres de L-G-D-M-E-M et hachez les tumeurs à l’aide d’une paire de ciseaux stériles. Ajoutez ensuite cinq millilitres de collagénase, un millilitre de disc pace, 75 microlitres de désoxyribonucléase et deux millilitres de L-G-D-M-E-M au tissu tumoral haché.Transférez le mélange de tissu contenant la collagénase depuis la boîte de Pétri vers un tube de dissociation tissulaire. À l’aide d’un programme de dissociation préréglé, effectuez deux cycles de dissociation de 62 secondes chacun. Incubez le tube avec agitation légère pendant 75 minutes à 37 degrés Celsius.Après l'incubation, filtrer le tissu digéré à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 microns placé sur un tube conique de 50 millilitres. Rincer le filtre avec cinq millilitres de tampon fax pour récupérer les cellules restantes et centrifuger le tube à 280 × g pendant cinq minutes. Retirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.Ensuite, diluez un millilitre de tampon de lyse des globules rouges à 10 x dans neuf millilitres d'eau stérile et resuspendez le culot pour lyser immédiatement les éventuels globules rouges contaminants. Centrifugez les cellules à 280 × g pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans 10 millilitres de tampon fax.Pour commencer la séparation immunomagnétique, comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et diluez-les à 10 puissance sept cellules par 100 microlitres. Dans du tampon FAX, ajoutez 10 microlitres de solution de blocage FCR par 100 microlitres et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Après le blocage, ajoutez aux cellules l’anticorps CD 31 conjugué à la PE, de rat anti-souris, et incubez-les sur de la glice pendant 10 à 15 minutes. En agitant occasionnellement, ajoutez 10 millilitres de tampon FAX au tube et centrifugez à 280 ×g pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le surnageant et lavez le culot cellulaire avec cinq millilitres de tampon fax. Effectuez une nouvelle centrifugation à 280 × g pendant cinq minutes afin de récupérer les cellules, puis aspirez le surnageant. Ajoutez maintenant du tampon fax et des microbilles anti-PE aux cellules, puis incubez-les sur de la glace pendant 10 à 15 minutes. En agitant occasionnellement, ajoutez 10 millilitres de tampon fax et centrifugez les échantillons à 280 × g pendant cinq minutes.Lavez les cellules avec cinq millilitres de tampon fax, centrifugez et éliminez le surnageant après avoir ajusté le volume à 300 microlitres. Passez les cellules dans un tube muni d’un filtre à cellules de 35 microns, à l’aide du tampon fax, par centrifugation à 280 × g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant pour la séparation magnétique.Installez un support magnétique multis et des colonnes magnétiques. Dans la hotte de culture cellulaire, fixez une colonne au séparateur magnétique, puis équilibrez la colonne avec deux millilitres de tampon fax. Ensuite, resuspendez le culot cellulaire dans un demi-millilitre de tampon fax et faites passer la suspension cellulaire à travers la colonne magnétique préalablement équilibrée.Lavez la colonne trois fois avec deux millilitres de tampon fax en récupérant l'écoulement dans un tube conique de 15 millilitres. Retirez la colonne du séparateur magnétique et élué avec deux millilitres de tampon fax en utilisant un piston pour vous assurer que toutes les cellules sont retirées de la colonne. Récupérez l'éluat dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.Centrifuger la fraction éluée à 280 × g pendant cinq minutes et éliminer le surnageant resus. Suspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu pour cellules endothéliales, répartis équitablement. Répartir la suspension cellulaire dans au moins quatre boîtes de culture cellulaire de 10 centimètres revêtues de gélatine et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à une confluence attendue d’environ 1 % le lendemain.Des colonies de cellules endothéliales devraient commencer à se former après sept à dix jours et atteindre un diamètre de trois à cinq millimètres. Au fur et à mesure que les colonies apparaissent après sept à dix jours, éliminez toute cellule non spécifique environnante à l’aide d’une pipette stérile de 200 microlitres. Une fois que les colonies ont atteint la taille appropriée, observez les boîtes au microscope à contraste de phase avec un grossissement de 4 x ou 10 x et délimitez les colonies individuelles sur le fond de la boîte de culture. À l’aide d’un marqueur à pointe fine, lavez la plaque avec 10 millilitres de PBS et aspirez en laissant une petite quantité de PBS pour maintenir les cellules humides.À l’aide d’une paire de forceps de dissection, prendre un anneau de clonage et pipeter environ un demi-microlitre d’adhésif tissulaire sur le fond. Répartir uniformément l’adhésif tissulaire sur la totalité du fond de l’anneau de clonage à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres. Placer l’anneau de clonage au-dessus de la colonie de cellules endothéliales en utilisant les marques comme guide.Appuyez doucement sur l'anneau de clonage pour coller l'anneau sur la plaque. Ensuite, pipetez 25 microlitres de solution enzymatique de détachement cellulaire dans l'anneau de clonage et incubez pendant environ une minute ou jusqu'à ce que les cellules soient faiblement attachées. Pipetez les cellules de chaque anneau de clonage dans un puits d'une six. Plaque de culture. Laver l'anneau avec 50 microlitres de milieu pour cellules endothéliales afin de récupérer les cellules restantes et les transférer dans le même puits de la plaque de culture à six puits. Faire croître des colonies isolées dans la plaque à six puits jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 80 à 100 % avant de transférer les cellules dans une nouvelle boîte. L'isolement immuno-magnétique des cellules endothéliales seul entraîne souvent une contamination de la culture par des cellules non endothéliales.Ici, les cellules endothéliales spécifiquement marquées par un colorant, I-A-C-L-D-L, peuvent être observées en mélange avec des cellules non endothéliales non marquées. Après utilisation d'anneaux clonaux pour les colonies, même les populations cellulaires amplifiées présentent une coloration uniforme au DI IAC LDL, indiquant qu'il s'agit de populations pures de cellules endothéliales, comparées à trois colonies isolées séparément. Des populations distinctes et uniformes positives pour le CD31 sont apparentes.Le CD31 est un marqueur des cellules endothéliales, tandis que l'IgG sert de contrôle négatif d'isotype pour la liaison non spécifique des anticorps. Ces populations cellulaires présentaient également une expression accrue des gènes marqueurs des cellules endothéliales, entre 200 et 7 000 fois plus élevée que celle observée dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Enfin, les cellules endothéliales normales ou tumorales isolées conservent leur fonction, comme en témoigne la formation spontanée de structures de type vaisseau sanguin en culture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une isolation de haute fidélité de cellules endothéliales spécifiques aux tumeurs en utilisant un enrichissement immunomagnétique, couplé à une sélection de colonies et à une expansion in vitro.

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