Photothrombosis induite par ischémie focale comme un modèle de lésion médullaire chez la souris

L’objectif global de cette procédure est de développer un modèle facile et hautement reproductible de l’ischémie de la moelle épinière chez la souris. Pour ce faire, on dissèque d’abord chirurgicalement la surface dorsale de la souris afin d’exposer les vertèbres T neuf à T 12. Dans la deuxième étape, une perceuse à grande vitesse est utilisée pour amincir la surface dorsale des vertèbres T 10 ou T 11 exposant les vaisseaux spinaux postérieurs.

Un colorant photoactif est ensuite administré via la racine rétroorbitaire pour marquer les vaisseaux sanguins. Dans la dernière étape, les vaisseaux spinaux postérieurs de la surface dorsale de la moelle épinière sont irradiés pour induire une photo-thrombose dans le vaisseau sanguin exposé. En fin de compte, l’issue de la lésion de la moelle épinière est évaluée par nissle, coloration et immunohistochimie.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’ischémie de la moelle épinière, car elle peut être utilisée pour tester l’efficacité de divers médicaments neuroprotecteurs visant à améliorer la survie cellulaire et la récupération après une lésion de la moelle épinière. La démonstration de la procédure sera faite par Nana, moi-même chercheuse, tous deux du laboratoire du Dr She.

Avant de commencer l’opération, préchauffez la lampe alliée en métal pendant 30 minutes pour stabiliser la puissance de la lampe. Ensuite, à l’aide de l’objectif 10 x et de la théorie, ajustez le diaphragme de champ d’un microscope à épifluorescence FN one droit pour régler la taille de la région éclairée à 0,75 millimètre de diamètre. Ensuite, appliquez une pommade lacrymale artificielle sur les deux yeux d’une souris anesthésiée et placez l’animal sur un coussin chauffant préchauffé.

Confirmer l’état d’anesthésie approprié par une absence de réponse au pincement des orteils. Ensuite, utilisez une tondeuse à cheveux électrique pour couper les poils sur la surface dorsale de l’animal autour de la ligne médiane. Frottez le site chirurgical avec de l’éthanol à 70 %, suivi d’une solution de bétadine trois fois, puis drapez l’animal.

Maintenant, placez l’animal en position couchée sur un coussin chauffant homéothématique sur une plate-forme chirurgicale à l’aide d’une pince de museau pour sécuriser l’animal et maintenir une région du cou allongée. Ensuite, commencez l’opération en pratiquant une incision le long de la ligne médiane dorsale des vertèbres thoraciques T neuf à T 12. En écartant la peau pour exposer la zone chirurgicale à l’aide d’un scalpel, dégagez soigneusement le muscle pour exposer les épines dorsales des vertèbres T 9 à T 12, en arrêtant le saignement si nécessaire avec l’application douce d’un coton-tige stérile.

Ensuite, séparez les vertèbres T 10 à T 12 du muscle environnant et fixez-les avec une pince vertébrale pour stabiliser l’animal et empêcher tout mouvement à l’aide d’une perceuse à grande vitesse équipée d’un foret à polir les os. Maintenant, amincissez soigneusement et doucement la surface dorsale de la vertèbre T 10 ou T 11 pour visualiser la veine spinale postérieure et d’autres petits vaisseaux sur la surface dorsale de la moelle épinière. Faites attention lors de cette étape car une pression excessive peut faire pénétrer la perceuse dans la cavité vertébrale et endommager la moelle épinière, tandis qu’un amincissement inégal de l’os peut entraîner une élimination inappropriée et la production d’infarcs irréguliers.

Pour éviter les dommages thermiques pendant la procédure d’éclaircissage, appliquez un jet doux et constant de solution saline normale ainsi qu’une aspiration constante pour éliminer les débris. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, lissez soigneusement la surface de l’os jusqu’à ce que le vaisseau principal soit clairement visible. En prenant soin de ne pas endommager la moelle épinière.

Une fois que le vaisseau sanguin est visible, utilisez une seringue à insuline pour administrer le colorant photo-actif à travers le sinus rétroorbitaire. Trois minutes après l’injection, mesurez le débit sanguin à l’aide d’un débitmètre laser Doppler pour induire une photothrombose. Placez l’animal sur une position XY, une platine réglable sur une prise de laboratoire réglable en hauteur en déplaçant la souris jusqu’à ce que la région exposée de la moelle épinière soit directement sous l’objectif 10 x du microscope.

Réglez la puissance de la source lumineuse sur 12 % et irradiez la région exposée au milieu de la moelle épinière amincie à travers l’objectif 10 x pendant deux minutes. Obtenez des images au début et à la fin de l’irradiation en enregistrant le temps de chaque capture d’image. Si aucune hémorragie n’est observée, utilisez une suture résorbable de quatre tailles oh pour fermer le fascia superficiel ainsi que les muscles de chaque côté de la moelle épinière, suivie d’une fermeture de la peau avec la même, puis appliquez un antiseptique sur les bords de la peau et replacez l’animal sur le coussin chauffant.

Lorsque l’animal est complètement rétabli. Vérifiez les signes de déficits neurologiques en observant le mouvement des deux membres postérieurs pour confirmer l’induction de l’ischémie. Les changements dans le flux sanguin peuvent être mesurés à l’aide d’un débitmètre laser Doppler avant et après une photothrombose.

Comme nous venons de le démontrer dans cette expérience, le flux sanguin est tombé à environ 20 % immédiatement après l’éclairage de la lumière par rapport au niveau basal ici, des images fluorescentes des vaisseaux sanguins de la moelle épinière au début et à la fin de la photothrombose sont montrées. Notez la formation d’un caillot sanguin après la photopériode de deux minutes suggérant l’induction d’une ischémie et compatible avec la réduction du débit sanguin mesurée par le débitmètre laser Doppler. Dans cette série de coupes transversales de la moelle épinière rostrale d’un épicentre normal et induit par une photothrombose trois jours après la photothrombose, une région d’infarctus clairement délimitée indiquant la présence de lésions tissulaires de la moelle épinière et la mort cellulaire dans les tissus photo-éclairés peut être observée.

En effet, l’immunocoloration du tissu de la moelle épinière trois jours après la thrombose a révélé une perte de nouveaux neurones positifs dans la matière grise du noyau ischémique. Alors que l’expression de GFAP était augmentée dans la bordure du noyau ischémique, la microglie positive IBA One présentait également une morphologie G OID, ainsi qu’une augmentation de l’expression IBA One avec une augmentation globale de l’expression GFAP et IBA One dans l’ensemble de la région par infarctus, indiquant une mort neuronale et une gliose réactive dans la pénombre après une ischémie de la moelle épinière. D’autres déficits fonctionnels importants, tels qu’une incapacité à bouger des membres postérieurs un jour après une photothrombose, ont également été observés chez les animaux blessés.

À la suite de cette procédure, une méthode telle que deux méthodes photomicroscopiques peut être réalisée pour répondre à des questions supplémentaires telles que, quels sont les rôles de la dégénérescence axonale, de la régénération et de la signalisation neuronale du calcium acétique dans l’ischémie de la moelle épinière ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’amincir la surface dorsale des vertèbres T 10 RT 11 et d’éradiquer les vaisseaux sanguins postérieurs de la colonne vertébrale exposés.