Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)
24 décembre 2015
Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) apparaissent de plus en plus pertinentes pour l'application clinique. L'utilisation d'un système de co-culture de cellules souches mésenchymateuses et leucocytes du sang périphérique pré-colorées avec le succinimidyl ester de carboxyfluorescéine fluorescent du colorant (CFSE), nous décrivons l'évaluation de l'immunomodulation MSC in vitro sur la prolifération des leucocytes et effectrice des sous-populatio
L'objectif général de cette expérience est d'évaluer les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines ou msc. Cette méthode peut aider à élucider les mécanismes impliqués dans l'immunomodulation par les cellules souches mésenchymateuses humaines, un processus qui pourrait présenter un intérêt thérapeutique. Le principal avantage de cette technique est que la prolifération des effecteurs, des leucocytes, ainsi que le nombre de divisions cellulaires peuvent être évalués, démontrant que la procédure sera effectuée par chaussure.
Un technicien de mon laboratoire pour isoler les PBMC commence par diluer 25 millilitres d'un échantillon de sang total hépariné avec 25 millilitres de PBS dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajouter 15 millilitres de Ph i, call pack, un gradient de densité, dans un nouveau tube de 50 millilitres. Puis, en tenant le tube incliné, superposer lentement la suspension cellulaire diluée sur le gradient de densité.
En prenant soin de cela, il n'y a pas de mélange entre les couches. L'une des étapes les plus critiques de cette expérience consiste à déposer le sang en couches sans perturber le gradient de densité. Cela permet de garantir une haute pureté et une faible contamination par les globules rouges des pbmc isolés.
Maintenant, séparez les cellules par centrifugation. Trois couches distinctes devraient être visibles : la couche plasmatique supérieure, la couche inférieure de gradient de densité du milieu Ficoll et une fine couche intermédiaire de PBMC.
À l’aide d’une pipette PE, retirez la couche supérieure en prenant soin de ne pas aspirer la couche d’interphase. Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer soigneusement les pbmc dans un tube conique de 50 millilitres. Mélangez les cellules avec 20 millilitres de PBS, puis centrifugez-les pour éliminer toute trace de gradient de densité.
Ensuite, lavez le culot dans 20 millilitres supplémentaires de PBS pour éliminer les plaquettes. Resuspendez le second culot dans un milieu complet pour leucocytes à une concentration de un fois 10 puissance sept cellules par millilitre. Pour préparer une co-culture de leucocytes et de CSM, préchauffez le milieu complet pour CSM à 37 degrés Celsius pendant pas plus de 30 minutes.
Ensuite, ensemencer cinq fois 10 à la puissance 4 MSC par millilitre de milieu complet pour MSC par puits dans des plaques de 24 puits pour une adhésion nocturne à 37 degrés Celsius, en laissant les cellules atteindre une confluence de 80 %. Le lendemain matin, aspirer le milieu et ajouter le nombre approprié de PBMC marqués au CFSE aux MSC dans un millilitre de milieu complet pour leucocytes. À un rapport de un MSC pour 10 PBMC, activer les cellules avec 10 microgrammes de PHA par millilitre de milieu complet pour leucocytes.
Ensuite, aux jours trois et cinq de la co-culture, transférez le nombre approprié de cellules de la co-culture dans des tubes coniques et évaluez la prolifération des leucocytes marqués au CFSE par analyse cytométrique en flux afin de réaliser un test de suppression des effecteurs. Commencez par mettre en place une co-culture M-S-C-P-B-M-C comme vient d'être démontré, avec 2,5 × 10⁶ pBMCs mis en co-culture avec 250 000 MSCs. Cela permet de s'assurer qu'il y a suffisamment de pBMCs en co-culture avec les MSCs pour la sélection des sous-populations.
Après 48 à 72 heures à 37 degrés Celsius, sélectionner les leucocytes immunomodulateurs induits par les CSM d'intérêt à l'aide des billes magnétiques appropriées. Ensuite, ajouter les lymphocytes T allogéniques marqués au CFSE et positifs pour le CD quatre dans un millilitre de milieu complet pour leucocytes par puits, selon différents rapports expérimentaux. Puis, ajouter les microbilles conjuguées anti-CD 3 28 à un rapport bille sur cellule de un pour un afin de stimuler les lymphocytes T positifs pour le CD quatre.
Le troisième jour de la co-culture, évaluer la prolifération des lymphocytes T CD4 positifs marqués au CFSE par cytométrie en flux. Les CSM sont des cellules adhérentes présentant une morphologie fibroblastique en fuseau, tandis que les PBMC et les leucocytes sont de petites cellules rondes non adhérentes, ce qui permet de distinguer clairement ces deux populations cellulaires. En co-culture, en l'absence de prolifération, les cellules marquées au CFSE apparaissent sous forme d'un seul pic fortement positif et nettement fluorescent lorsque les cellules ont été activées.
La prolifération se manifeste par plusieurs pics plus petits accompagnés d'une perte et d'un décalage vers la gauche de l'intensité de fluorescence lorsque la suppression de la prolifération a eu lieu. Par exemple, dans une co-culture de CSM, le nombre de pics plus petits diminue simultanément avec une augmentation de l'intensité de fluorescence, comme en témoigne le déplacement des pics vers la droite et l'augmentation de la netteté du pic le plus à droite, qui représente les cellules non divisées dans un test de suppression effectrice. L'effet suppresseur des CSM sur la prolifération des lymphocytes T CD4 positifs peut être évalué davantage de manière dépendante de la dose.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer l'immunomodulation par les cellules souches mésenchymateuses humaines. N’oubliez pas que le travail avec des cellules humaines peut présenter des risques et que des précautions doivent toujours être prises.
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Aperçu
Cette étude examine les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) à l'aide d'un système de co-culture avec des leucocytes sanguins périphériques. L'évaluation porte sur la prolifération des leucocytes effecteurs et des sous-populations spécifiques, mettant en évidence la pertinence thérapeutique potentielle des CSM.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Recherche sur les cellules souches
- Prolifération cellulaire
Contexte
- Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) possèdent des propriétés immunomodulatrices.
- La compréhension des interactions entre les MSC et les leucocytes est essentielle pour les applications thérapeutiques.
- La prolifération des leucocytes effecteurs est un aspect clé de la réponse immunitaire.
- Les systèmes de co-culture peuvent modéliser efficacement ces interactions in vitro.
Objectif de l'étude
- Évaluer les effets immunomodulateurs des CSM sur la prolifération des leucocytes.
- Élucider les mécanismes de l'immunomodulation par les CSM.
- Explorer la pertinence thérapeutique des CSM dans les applications cliniques.
Méthodes utilisées
- Système de co-culture de cellules souches mésenchymateuses et de leucocytes sanguins périphériques.
- Utilisation de l'ester succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) pour le traçage cellulaire.
- Évaluation de la prolifération des leucocytes effecteurs.
- Analyse de sous-populations spécifiques de leucocytes.
Résultats principaux
- Démonstration de la modulation par les CSM de la prolifération des leucocytes.
- Identification de sous-populations spécifiques affectées par les CSM.
- Apport d'éléments sur les mécanismes d'immunomodulation par les CSM.
- Mise en évidence du potentiel thérapeutique des CSM.
Conclusions
- Les CSM exercent des effets immunomodulateurs importants sur les leucocytes.
- Les résultats appuient l'utilisation thérapeutique des CSM en milieu clinique.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pleinement les mécanismes impliqués.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation de la fonction immunomodulatrice des CSM par des dosages de prolifération des leucocytes basés sur le CFSE fournit une méthode quantitative et reproductible pour apprécier le potentiel thérapeutique dans les maladies immuno-médiées. Cette approche soutient la validation des cibles en permettant une détection mécanistique des risques liés à l'immunosuppression induite par les CSM avant tout investissement préclinique. L'adaptabilité du dosage à des sous-populations spécifiques de leucocytes renforce la confiance prédictive dans le choix des candidats prioritaires pour les pipelines immunomodulateurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'analyser la suppression, par les CSM, de la prolifération des leucocytes effecteurs comme indicateur fonctionnel de l'activité immunomodulatrice.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode normalisée, basée sur un marquage, pour quantifier l'historique des divisions et la cinétique de prolifération, sans recourir à la radioactivité.
- Valeur scientifique : Facilite le criblage phénotypique des donneurs de CSM ou des stratégies de pré-conditionnement en mesurant la suppression de la prolifération des leucocytes marqués au CFSE.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Permet l'isolement et le suivi de sous-populations spécifiques de leucocytes (par exemple, les lymphocytes T CD4+) par sélection magnétique à l’aide de billes avant la co-culture, permettant ainsi un profilage de l’immunomodulation propre à chaque sous-population.
- Valeur opérationnelle : Les profils de dilution du CFSE obtenus par cytométrie en flux fournissent des données quantitatives et multiparamétriques sur la suppression de la prolifération et l’historique des divisions cellulaires.
- Valeur scientifique : Facilite l’évaluation de la relation dose-réponse de l’immunomodulation par les CSM dans différentes conditions de rapport CSM:leucocytes et d’activation (par exemple, stimulation par PHA).
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre la puissance immunomodulatrice in vitro et l'efficacité clinique potentielle dans les maladies liées au système immunitaire, en modélisant la communication entre les CMM et les leucocytes.
- Valeur opérationnelle : Permet un échantillonnage longitudinal (par exemple, aux jours 3 et 5) afin d’évaluer la dynamique temporelle de la suppression et du rétablissement.
- Valeur scientifique : Permet une évaluation alignée sur les biomarqueurs en corrélant la suppression de la prolifération avec l’expression intracellulaire de cytokines dans les leucocytes en co-culture.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de prolifération des leucocytes basé sur le CFSE s'intègre aux flux de travail de découverte précoce en tant qu'outil de criblage immunomodulateur fonctionnel, assurant la transition entre la validation de la cible et l'optimisation des candidats pour les thérapeutiques à base de CSM.
- Biologie de la découverte : Teste l'hypothèse selon laquelle les CSM suppriment la prolifération des leucocytes, offrant ainsi un éclairage mécanistique sur les voies immunosuppressives.
- Tri : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles permettant la comparaison de lots de CSM, de donneurs ou de conditions de préparation.
- Analytique : Génère des données de cytométrie en flux capables de distinguer les pics de prolifération, de suivre les divisions cellulaires et d'analyser les réponses spécifiques à des sous-populations au sein d'une population hétérogène de leucocytes.
- Recherche translationnelle : Modélise in vitro les interactions entre cellules immunitaires humaines et CSM, facilitant l'extrapolation à des contextes cliniques d'immunomodulation.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme modulaire et adaptable, applicable à divers types de cellules immunitaires et à des conditions de stimulation pertinentes pour les maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant une preuve directe et quantifiable de la suppression des leucocytes par les CSM.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation des tests grâce à des rapports définis entre CSM et leucocytes, à des protocoles d'étiquetage par CFSE et à des stratégies de tri cytométrique en flux.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en identifiant précocement les CSM dotées d'une activité immunomodulatrice puissante et reproductible.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats CSM selon leur force immunomodulatrice fonctionnelle, plutôt que d'après des marqueurs phénotypiques uniquement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans l'isolement des leucocytes primaires, le marquage au CFSE et l'analyse en cytométrie en flux multicolore.
- Dépend de l'accès à des cytomètres en flux capables de résoudre les pics de dilution du CFSE et à des systèmes de séparation par billes magnétiques pour l'isolement des sous-populations.
- Implique une standardisation des conditions d'activation des leucocytes (par exemple, concentration en PHA) et des protocoles de pré-culture des CSM entre différents sites.
- Exige une optimisation des rapports CSM:leucocytes et de la durée de co-culture afin d'éviter les artefacts liés à une surcroissance ou à l'épuisement des nutriments.
- Est limitée par la variabilité inter-donneurs de la réponse des leucocytes, nécessitant l'utilisation de témoins groupés ou appariés pour obtenir des mesures de suppression reproductibles.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
