Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR

L’objectif global de cette procédure est d’identifier avec précision le sexe des embryons de porc du 30e jour, en utilisant l’ADN sans phénol obtenu à partir de chaque embryon. Et deux paires d’amorces spécifiques au sexe pour une réaction PCR. Cette méthode a le potentiel de répondre à diverses questions liées à la physiologie de la reproduction chez le bétail, telles que l’effet des facteurs maternels sur le rapport des sexes, y compris la capacité utérine et l’état métabolique de la truie, ainsi que divers facteurs paternels.

L’avantage de cette technique est l’absence de produits chimiques toxiques tels que le phénol-chloroforme, ou de colonnes coûteuses lors de la purification de l’ADN. Alors, mettons le spectacle sur la route. La démonstration visuelle de cette méthode est aussi importante que la préparation des symptômes.

Les étapes sont faciles à apprendre, mais un soin particulier est important pour éviter la contamination croisée des symptômes. Transférez les échantillons d’embryons dans un congélateur à quatre-vingts degrés Celsius, selon le texte. Étiquetez les tubes d’échantillon avec l’ID de l’échantillon nécessaire pour le nombre d’échantillons à analyser.

Utilisez de la glace sèche pour remplir à moitié un récipient thermique et insérez un tube d’échantillon pré-étiqueté dans la glace sèche. Tout en portant des gants d’hiver, avec une paire de gants d’examen sur le dessus, transférez les mortiers et les pilons pré-refroidis du congélateur à moins quatre-vingts degrés Celsius dans un récipient de glace sèche. Ensuite, placez un embryon congelé à l’intérieur du mortier sur la glace sèche, puis versez suffisamment d’azote liquide pour couvrir l’embryon.

Et utilisez un pilon pour le broyer en une poudre fine. À l’aide d’une microspatule, transférez la poudre d’embryon dans un tube d’échantillon pré-étiqueté et placez le tube dans le congélateur à moins quatre-vingts degrés. Répétez le broyage et la congélation de chaque embryon supplémentaire, en changeant les gants d’examen entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.

Après avoir étiqueté tous les tubes microcentrifugés nécessaires pour le nombre d’échantillons à analyser, transférez les tubes d’échantillon contenant de la poudre d’embryon du congélateur négatif de quatre-vingts degrés Celsius dans un récipient de glace sèche. Pipeter 180 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires dans chaque tube microcentrifugé pré-étiqueté. Préchauffez un incubateur à quatre-vingt-quinze degrés Celsius.

À l’aide d’un cure-dent, transférez environ cinq à dix milligrammes de poudre d’embryon d’un tube d’échantillon dans un tube pré-étiqueté d’hydroxyde de sodium. Soulevez lentement le cure-dent de la solution pour visualiser le lysat d’ADN sous la forme d’une substance blanche collante, semblable à une substance transparente. Transférez les échantillons avec du lysat d’ADN dans l’incubateur à quatre-vingt-quinze degrés Celsius pendant cinq minutes, puis transférez immédiatement le tube dans un récipient isolé rempli de glace.

Ensuite, ajoutez vingt microlitres d’une molaire de trichlorhydrate directement dans les tubes et tapotez les tubes pour mélanger délicatement. Avec du papier pH, assurez-vous que le pH est d’environ 8,0. Ensuite, centrifugez les tubes à deux mille G et à température ambiante pendant deux minutes pour éliminer les débris de tissus non dissous.

Transférez 150 microlitres du surnageant transparent supérieur dans de nouveaux tubes. Ou, une plaque à 96 puits. Et conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines.

Ou, moins vingt degrés Celsius jusqu’à un an. Le succès de ce protocole repose sur la précision avec laquelle vous concevez votre amorce sur les chromosomes X et Y. Alors, comment s’assurer qu’ils sont sur les chromosomes X et Y ?

L’utilisation de NCBI Map Viewer est le meilleur moyen de le montrer. Pour concevoir des amorces spécifiques au sexe pour la PCR, utilisez le site Web du NCBI pour obtenir les numéros d’accession pour la région déterminante du sexe du signe des pores Y.Or SRY et la protéine à doigt de zinc liée à l’X, ou ZFX. Copiez et collez les numéros d’acquisition dans un outil de conception d’amorces en ligne.

Utilisez le souffle nucléotidique ou le blaste N pour valider la spécificité des amorces par rapport à la base de données génomique actuelle des signes de pores 104. Pour entrer dans les séquences, ne sont situées que sur les chromosomes X et Y pour SRY et ZFX, respectivement. Pour effectuer une PCR avec les lysats d’ADN, utilisez n’importe quelle enzyme PCR prête à l’emploi et préparez un mélange maître en ajoutant deux amorces spécifiques au sexe à une concentration finale de 0,3 micromolaire dans une réaction PCR de 15 microlitres.

Pour la première fois, les réactions préparent un tube PCR pour le contrôle négatif sans modèle, et deux tubes supplémentaires pour les contrôles positifs en ajoutant un microlitre d’ADN génomique de signe de pore sexuel obtenu commercialement. Pour les cycles ultérieurs de PCR, inclure un microlitre d’un échantillon de la dernière analyse de sexage réussie comme témoin positif. Configurez le programme PCR suivant dans un thermocycleur et effectuez la PCR.

Pour varier les échantillons après la PCR, préparez un gel d’agarose à 2 % TBE avec une coloration au gel d’ADN cyber ou au bromure d’éthidium. Ajoutez 1,5 microlitre de colorant de chargement 10X aux échantillons avant de les charger sur le gel et de les faire couler. Observez et ajustez l’intensité de la bande sous la lumière fluorescente et capturez une image du gel.

Identifiez les embryons avec une bande comme femelle et deux bandes comme mâle. Voici un résultat représentatif de la détermination du sexe à partir de 345 lysats d’ADN examinés par PCR. La température de recuit optimale de l’amorce de 65 degrés Celsius est légèrement supérieure à la TM des amorces montrées ici pour générer une intensité similaire et des tailles d’ampilcon prévues.

Deux produits amplifiés de SRY et ZFX sont présentés ici. L’échantillon de lysat d’embryons féminins ne produit qu’une seule bande de 506 paires de fragments d’ADN du gène ZFX situé sur le chromosome X. Tous les embryons mâles produisent deux fragments d’ADN d’une intensité égale de 400 paires de bases pour SRY et de 506 paires de bases pour ZFX.

Comme le montre ici, les lysats d’ADN n’ont montré aucune inhibition de la réaction PCR après le criblage de 345 embryons. Seuls trois individus n’étaient pas sexés et le pourcentage d’embryons féminins était légèrement supérieur à celui des mâles. Une fois cette technique maîtrisée, du broyage à la réalisation de la PCR, il faut environ une heure pour traiter une dizaine d’embryons.

Lors de l’utilisation de cette technique, il est important d’éviter la contamination croisée, en particulier lors du transfert de poudre d’embryon dans les tubes. À la suite de cette procédure, nous pouvons utiliser d’autres méthodes telles que la méthylation de l’ADN, les microréseaux et le séquençage pour étudier les effets génomiques et épigénétiques de la nutrition et des maladies infectieuses entre les sexes. Le développement de cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans les domaines de la physiologie de la reproduction et des sciences animales pour mener des recherches liées au dimorphisme sexuel chez diverses espèces de bétail.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir des amorces spécifiques au sexe, d’extraire l’ADN des embryons et d’effectuer une réaction PCR à l’aide de lysats d’ADN. N’oubliez pas que travailler avec de la glace sèche est assez dangereux, alors prenez les précautions appropriées, portez des gants et des lunettes de protection.