encapsulation cytochrome

L'objectif général de cette procédure est d'encapsuler le cytochrome c dans des sols-gels de silice. Pour traiter ces gels de manière supercritique afin de former des bioaérogels, et utiliser ces bioaérogels pour détecter rapidement l'oxyde nitrique par une réaction en phase gazeuse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du biosenseur et de la bioanalyse, telles que quelles conditions sont nécessaires pour que le cytochrome c reste actif lorsqu'il est encapsulé dans un aérogel hautement poreux ?

L'importance de cette technique réside dans le fait qu'il s'agit d'une procédure simple permettant d'encapsuler une protéine dans une matrice dans laquelle les protéines n'ont que rarement été encapsulées avec succès. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cytochrome c, elle pourrait également conduire à des avancées méthodologiques pour l'encapsulation d'autres protéines dans des aérogels, avec des implications potentielles pour les futurs dispositifs bioanalytiques. Préparez une solution ayant une concentration en cytochrome c comprise entre 0,7 et millimolaire.

Ainsi qu'une solution de cytochrome c diluée à 0,105 millimolaire, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, étiquetez un bécher jetable en polypropylène de 50 millilitres, Bécher A. Placez le bécher sur le plateau d'une balance analytique et utilisez une pipette Pasteur en verre pour ajouter 1,88 gramme de tétraméthoxysilane dans le bécher. Remettez la balance à zéro.

Ensuite, pipetez 2,88 grammes de méthanol dans le bécher A. Couvrez le bécher A avec du parafilm. Puis, ajoutez une barre d'agitation magnétique à un bécher jetable en polypropylène de 50 millilitres étiqueté Bécher B, et placez-le sur le plateau d'une balance analytique. Utilisez une pipette en verre pour ajouter 0,75 gramme d'eau et 3,00 grammes de méthanol avant de couvrir le bécher B avec du parafilm.

Commencez à agiter le contenu du bécher B sur une plaque d'agitation située à l'intérieur d'une hotte chimique. Ensuite, utilisez une seringue pour introduire 5 microlitres de solution d'hydroxyde d'ammonium à 28,0 à 30,0 % à travers le couvercle en parafilm dans le mélange en cours d'agitation. Dès que cette étape est terminée, ajoutez le contenu du bécher A dans le bécher B. Agitez le mélange pendant 20 minutes en le maintenant recouvert de parafilm.

Pendant que le mélange de sol de silice est en cours d'homogénéisation, prélevez huit à neuf flacons en polypropylène pour scintillation et leurs bouchons correspondants. Recouvrez l'extrémité bouchon du flacon d'un film plastique afin de créer une surface plane sur laquelle le gel pourra se former, puis placez le bouchon par-dessus.

S'assurer que le film plastique reste intact à l'intérieur du bouchon. Placer les vials sur le plan de travail, le bouchon vers le bas et les extrémités ouvertes vers le haut. Ensuite, découper des morceaux de parafilm qui seront utilisés pour couvrir chaque vial.

Une fois le mélange du sol terminé, ajouter 3 millilitres du mélange de sol à un bécher propre en polypropylène jetable de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, laisser tomber très lentement 500 microlitres de la solution diluée de cytochrome c à 0,105 millimolaire le long de la paroi du bécher, dans le mélange de sol de 3 millilitres, sur une durée d’environ une minute. Veiller à agiter doucement le mélange pendant l’ajout du cytochrome c afin d’éviter la formation de gros agrégats rouges.

Introduisez 0,5 millilitre du sol de silice contenant le cytochrome c dans chaque moule préparé. Introduisez également 0,5 millilitre du sol de silice restant, non modifié, dans un ou deux moules afin de les utiliser comme échantillons témoins lors du processus de séchage supercritique. Recouvrez les ouvertures supérieures des moules avec du parafilm et placez-les au réfrigérateur pendant la nuit, ou au moins 12 heures, afin d'obtenir des gels sol-gel.

Sortez les moules du réfrigérateur. Retirez le parafilm du dessus d'un moule contenant un gel sol de cytochrome c, puis retirez également le bouchon et l'emballage plastique du bas. Après avoir ajouté un peu d'éthanol à l'aide d'une bouteille de rinçage dans le moule, utilisez l'extrémité circulaire en disque du piston d'une seringue pour pousser délicatement le gel hors du moule et dans un flacon en verre propre de 20 millilitres contenant environ 5 millilitres d'éthanol.

Répétez cette procédure de retrait du gel jusqu'à ce que tous les gels de cytochrome c soient ajoutés au flacon, et que tous les gels de silice soient ajoutés à un flacon distinct. Ensuite, remplissez les flacons d'éthanol jusqu'au bord. Boucher et conserver entre 2 et 8 degrés Celsius.

Toutes les quatre heures pendant la journée, sortez les gels du réfrigérateur. Décantez l'éthanol des gels et remplacez-le par de l'éthanol frais. Pendant trois jours supplémentaires, immergez les gels sol humides dans de l'acétone, en décantant et en ajoutant de l'acétone fraîche trois fois par jour.

Refroidir un appareil de séchage au point critique à 10 degrés Celsius en réglant la température d'un circulateur attaché à huit degrés Celsius. Une fois que l'appareil a atteint 10 degrés Celsius, effectuer un test d'étanchéité sur l'appareil comme décrit dans le protocole textuel. Après avoir vérifié que l'appareil ne présente aucune fuite, verser soigneusement les gels humides provenant des vials de scintillation, ainsi que la majeure partie de l'acétone, dans les trois sections longues du bateau de transfert.

Ajouter plus d'acétone si nécessaire afin de s'assurer que tous les gels sont complètement immergés dans l'acétone avant de sceller l'enceinte à l'intérieur de l'appareil. Ouvrir la vanne de remplissage de l'appareil pour y introduire du dioxyde de carbone. Une fois l'observation du dépôt de dioxyde de carbone au fond de l'appareil à travers la fenêtre de celui-ci, ouvrir la vanne de vidange pour évacuer l'acétone pendant cinq minutes.

Ce suintement de l'acétone vers le bas se produira avant que l'appareil ne soit complètement rempli de dioxyde de carbone. Par conséquent, laissez la vanne de remplissage ouverte pendant la vidange afin que l'appareil continue de se remplir. Ensuite, fermez la vanne de vidange.

Garder la vanne de remplissage légèrement entrouverte. Au départ, le mélange qui s'écoule contient de l'eau, car l'acétone n'est pas anhydre. Un gel, un colmatage et une accumulation de pression dans le tube de drainage sont possibles.

Si un bouchon est détecté, fermez la vanne de vidange jusqu'à ce que le bouchon fonde. Cinq minutes plus tard, ouvrez la vanne de vidange pendant cinq minutes supplémentaires et réglez la vanne de remplissage pour qu'elle soit suffisamment ouverte afin que l'appareil reste plein pendant toute la durée de vidange. Après cinq minutes, fermez la vanne de vidange et laissez la vanne de remplissage légèrement entrouverte.

Ensuite, répétez cette étape de vidange une fois de plus, cinq minutes plus tard. Une fois les étapes de vidange terminées, fermez le robinet de remplissage et évacuez le dioxyde de carbone liquide, de sorte que le niveau reste visible légèrement au-dessus des pointes du bateau à travers la fenêtre de l'appareil. Ensuite, réglez la température du circulateur attaché à l'appareil à 40 degrés celsius afin de garantir que le dioxyde de carbone liquide dépasse sa température et sa pression critiques.

Après environ 15 minutes, observer la transition du liquide vers le fluide supercritique à travers la fenêtre de l'appareil, lorsque le ménisque liquide au-dessus des dents du bateau disparaît. Après un temps d'équilibration d'au moins 15 minutes, ouvrir légèrement la vanne de purge pour commencer à libérer le fluide supercritique. Pendant environ 45 minutes, continuer à ouvrir progressivement la vanne de purge de plus en plus, de sorte qu'un sifflement régulier mais très faible du fluide en cours de libération puisse être entendu, et que l'on observe une diminution lente de la pression sur le manomètre jusqu'à zéro.

Une fois que la pression de l'appareil est retombée à zéro, ouvrez la porte de l'appareil. Retirez le creuset. Puis utilisez une pince pour placer les aérogels nouvellement séchés dans des vials en verre propres.

Les aérogels de silice contenant du cytochrome c sont désormais prêts à être utilisés pour détecter la présence de gaz d'oxyde nitrique, après leur caractérisation décrite dans le protocole textuel. Des aérogels encapsulant du cytochrome c à 15 micromolaire dans un tampon phosphate de potassium à 4,4 millimolaire, 40 millimolaire et 70 millimolaire sont présentés ici en comparaison avec un dix cents. On observe ici un spectre représentatif du cytochrome c en solution tampon comparé au cytochrome c encapsulé dans des aérogels sous diverses conditions.

Le pic de Soret du cytochrome c à 409 nanomètres reste essentiellement non décalé à l'intérieur des aérogels, et présente un décalage vers le rouge caractéristique lorsque les bioaérogels sont exposés à l'oxyde nitrique en phase gazeuse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment synthétiser des sols-gels de silice, encapsuler le cytochrome c dans ces sols-gels, puis sécher ces sols-gels composites pour former des aérogels. Des informations supplémentaires sont disponibles dans le protocole écrit concernant la caractérisation des bioaérogels, ainsi que sur l'utilisation des bioaérogels pour détecter l'oxyde nitrique en phase gazeuse.