encapsulation cytochrome c En silice aérogel nanoarchitectures sans métal Nanoparticules tout en Conservant en phase gazeuse bioactivité

L’objectif global de cette procédure est d’encapsuler le cytochrome c dans des sol-gels sicals. Traiter de manière super critique ces gels pour former des bioaérogels, et utiliser ces bioaérogels pour reconnaître rapidement l’oxyde nitrique par une réaction en phase gazeuse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biodétection et de la bioanalyse, telles que : quelles sont les conditions nécessaires pour que le cytochrome c reste actif lorsqu’il est encapsulé dans un aérogel hautement poreux ?

L’importance de cette technique est qu’il s’agit d’une procédure simple d’encapsulation d’une protéine dans une matrice dans laquelle les protéines n’ont pas souvent été encapsulées avec succès. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cytochrome c, elle peut également conduire à des développements procéduraux pour l’encapsulation d’autres protéines dans des aérogels, ce qui pourrait avoir une importance pour les futurs dispositifs bio-analytiques. Préparez une solution avec une concentration de cytochrome c comprise entre 0,7 et millimolaire.

Ainsi qu’une solution diluée de cytochrome c de 0,105 millimolaire, comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, étiquetez un bécher en polypropylène jetable de 50 millilitres, Bécher A.Placez le bécher sur la casserole d’une balance analytique et utilisez une pipette en verre pasteur pour ajouter 1,88 gramme de tétra méthoxy silane dans le bécher. Mettre le solde à zéro.

Ensuite, pipetez 2,88 grammes de méthanol dans le bécher A.Couvrez le bécher A avec du parafilm. Ensuite, ajoutez une barre d’agitation magnétique à un bécher jetable en polypropylène de 50 millilitres étiqueté Beaker B, et placez-le sur la casserole d’une balance analytique. Utilisez une pipette en verre pour ajouter 0,75 gramme d’eau et 3,00 grammes de méthanol avant de couvrir le bécher B avec du parafilm.

Commencez à remuer le contenu du bécher B sur une plaque d’agitation à l’intérieur d’une hotte. Ensuite, à l’aide d’une seringue, insérez 5 microlitres de solution d’hydroxyde d’ammonium à 28,0 à 30,0 % à travers le couvercle du parafilm dans le mélange tout en remuant. Dès que cette étape est terminée, ajoutez le contenu du bécher A au bécher B.Remuez le mélange pendant 20 minutes tout en le recouvrant de parafilm.

Pendant que le mélange de sol de silice se mélange, procurez-vous huit à neuf flacons à scintillation en polypropylène et les bouchons correspondants. Mettez une pellicule plastique sur l’extrémité du capuchon du flacon pour créer une surface plane sur laquelle le gel peut se former. Et placez le capuchon par-dessus.

Assurez-vous que la pellicule plastique reste intacte à l’intérieur du bouchon. Alignez les flacons avec l’extrémité du capuchon vers le bas sur le dessus de la paillasse et le fond ouvert vers le haut. Découpez ensuite des morceaux de parafilm qui serviront à recouvrir chaque flacon.

Une fois le mélange de sol terminé, ajoutez 3 millilitres du mélange de sol dans un bécher en polypropylène jetable de 50 millilitres propre. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, on dépose très lentement 500 microlitres de la solution de cytochrome c diluée à 0,105 millimolaire sur le côté du bécher dans le mélange de 3 millilitres de sol pendant environ une minute. Assurez-vous de faire tourner doucement le mélange tout en ajoutant le cytochrome c pour éviter la formation de gros amas rouges.

Pipeter 0,5 millilitre du cytochrome c silica sol obtenu dans chaque moule préparé. Pipetez également 0,5 millilitre du sol de silice ordinaire restant dans un ou deux moules à utiliser comme échantillons de contrôle pendant le processus de séchage super critique. Couvrez les ouvertures des moules avec du parafilm et mettez-les au réfrigérateur pendant la nuit, ou pendant au moins 12 heures pour produire des gels solaires.

Sortez les moules du réfrigérateur. Retirez le parafilm du haut d’un moule contenant un gel de cytochrome c, retirez également le capuchon et la pellicule plastique du bas. Après avoir ajouté de l’éthanol d’un flacon de lavage dans le moule, utilisez l’extrémité du disque circulaire d’un piston de seringue pour pousser soigneusement le gel hors du moule et dans un flacon à scintillation en verre propre de 20 millilitres contenant environ 5 millilitres d’éthanol.

Répétez cette procédure d’élimination du gel jusqu’à ce que tous les gels de cytochrome c soient ajoutés au flacon, et que tous les gels de silice soient ajoutés à un flacon séparé. Remplissez ensuite les flacons jusqu’en haut avec de l’éthanol. Boucher et conserver entre 2 et 8 degrés Celsius.

Toutes les quatre heures tout au long de la journée, sortez les gels du réfrigérateur. Décapsulez l’éthanol des gels et remplacez-le par de l’éthanol frais. Pendant trois jours supplémentaires, immergez les gels de sol humides dans de l’acétone, décantez et ajoutez de l’acétone fraîche trois fois par jour.

Refroidissez un appareil de séchage du point critique à 10 degrés Celsius, en réglant la température d’un circulateur attaché à huit degrés Celsius. Une fois que l’appareil a atteint 10 degrés Celsius, effectuez un test d’étanchéité sur l’appareil comme décrit dans le protocole texte. Après vous être assuré que l’appareil ne fuit pas, versez soigneusement les gels humides des flacons à scintillation, ainsi que la majeure partie de l’acétone dans les trois longues sections du bateau de transfert.

Ajoutez plus d’acétone si nécessaire pour vous assurer que tous les gels sont complètement immergés dans l’acétone avant de sceller le bateau à l’intérieur de l’appareil. Ouvrez la vanne de remplissage de l’appareil pour ajouter du dioxyde de carbone. Après avoir observé le dioxyde de carbone couler du bas de l’appareil à travers la fenêtre de l’appareil, ouvrez le robinet de vidange pour libérer l’acétone pendant cinq minutes.

Cette suintement de l’acétone vers le fond se produira avant que l’appareil ne soit complètement rempli de dioxyde de carbone. Par conséquent, gardez la vanne de remplissage ouverte pendant la vidange afin que l’appareil continue à se remplir. Ensuite, fermez le robinet de vidange.

Gardez la vanne de remplissage légèrement ouverte et ouverte. Au début, le mélange qui s’écoule contient de l’eau, car l’acétone n’est pas anhydre. Le gel, le colmatage et l’accumulation de pression dans le tube de vidange sont possibles.

Si un bouchon est détecté, fermez le robinet de vidange jusqu’à ce que le bouchon fonde. Cinq minutes plus tard, ouvrez la vanne de vidange pendant cinq minutes supplémentaires et ajustez la vanne de remplissage pour qu’elle soit suffisamment ouverte pour que l’appareil reste plein pendant toute la durée de vidange. Après cinq minutes, fermez le robinet de vidange et maintenez le robinet de remplissage ouvert.

Ensuite, répétez cette étape de vidange une fois de plus, cinq minutes plus tard. Une fois les étapes de vidange terminées, fermez la vanne de remplissage et vidangez le dioxyde de carbone liquide, de sorte que le niveau reste visible juste au-dessus des broches du bateau à travers la fenêtre de l’appareil. Ensuite, réglez la température du circulateur attaché à l’appareil à 40 degrés Celsius pour vous assurer que le dioxyde de carbone liquide dépasse sa température et sa pression critiques.

Après environ 15 minutes, observez la transition du liquide au fluide super critique à travers la fenêtre de l’appareil alors que le ménisque liquide au-dessus des broches du bateau disparaît. Après au moins 15 minutes de temps d’équilibre, ouvrez légèrement la soupape de purge pour commencer à libérer le fluide supercritique. Pendant environ 45 minutes, continuez à ouvrir progressivement la soupape de ventilation de plus en plus large de sorte qu’un sifflement constant mais très faible de liquide de libération puisse être entendu, et on observe que le manomètre diminue lentement jusqu’à zéro.

Une fois que la pression de l’appareil est tombée à zéro, ouvrez la porte de l’appareil. Retirez le bateau. Et utilisez des pinces pour placer les aérogels nouvellement séchés dans des flacons à scintillation en verre propre.

Les aérogels de silice du cytochrome c sont maintenant prêts à être utilisés pour détecter la présence de gaz d’oxyde nitrique, à la suite de la caractérisation décrite dans le protocole textuel. Des aérogels encapsulant 15 micromolaires de cytochrome c dans un tampon de phosphate de potassium de 4,4 millimolaires, 40 millimolaires et 70 millimolaires sont présentés par rapport à une pièce de dix cents. Illustré ici, un spectre représentatif du cytochrome c en tampon par rapport au cytochrome c encapsulé dans des aérogels dans diverses conditions.

Le pic du cytochrome c soret à 409 nanomètres reste essentiellement inchangé à l’intérieur des aérogels et donne un décalage vers le rouge caractéristique lorsque les bioaérogels sont exposés à de l’oxyde nitrique en phase gazeuse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des gels de sol de silice, d’encapsuler du cytochrome c dans ces gels de sol et de sécher ces gels de sol composite en aérogels. De plus amples informations peuvent être trouvées dans le protocole de texte sur la caractérisation des bioaérogels et sur l’utilisation des bioaérogels pour détecter le monoxyde d’azote en phase gazeuse.