Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du Ex Vivo Souris oreille peau

L’objectif global de ce nouveau protocole expérimental est de démontrer l’accessibilité des follicules pileux dans l’oreille de la souris, afin d’étudier la fonction des terminaisons nerveuses mécanosensorielles entièrement différenciées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences mécanosensorielles, telles que le rôle des vésicules de type synaptique dans la sensation mécanique. Les deux principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide et qu’elle donne un accès optique facile à d’innombrables terminaisons nerveuses mécanosensorielles vivantes entièrement différenciées.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir du mal à obtenir une séparation de la peau et à dégager correctement le cartilage sans endommager les follicules. En plus de montrer la technique de base, nous montrerons également ici l’exemple d’une expérience, en examinant la dépendance au calcium d’une partie vitale de la fonction de la terminaison nerveuse. Remplissez un plat de 50 millimètres tapissé de silicone avec la solution de Liley ou une autre solution saline physiologique.

Rafraîchissez la solution toutes les 15 minutes ou utilisez une perfusion constante. Après avoir décapité une jeune souris adulte, à l’aide de ciseaux, retirez les oreilles externes près de la base, juste au-dessus de la ligne dense des cheveux, et transférez les pennes dans le plat. Maintenant, épinglez une oreille, côté concave vers le bas, le long des marges, à l’aide de fines épingles à insectes.

Ensuite, décollez soigneusement la peau postérieure exposée à l’aide d’une dissection émoussée. À l’aide de la pince numéro 3, saisissez la peau postérieure centrale et, à l’aide d’une autre paire de pinces, percez l’espace entre la peau et le cartilage à la base de l’oreille. Travaillez doucement la pince d’un côté à l’autre dans l’espace, en séparant progressivement les couches de peau antérieure et postérieure.

Déplacez-vous systématiquement à travers le cartilage central jusqu’aux fines marges sans cartilage. Cela demandera de la pratique. Après avoir retiré la peau postérieure, épinglez-la, côté dermique vers le haut, à côté de la peau antérieure.

Une fois le cartilage retiré sur les deux préparations cutanées, retirez la couche de cartilage fibreélastique mousseux qui recouvre la base des follicules pileux. Pelez, plumez et frottez doucement ce tissu. Il faudra également de la pratique pour maîtriser.

En enlever trop peu obstrue le colorant et sa visualisation, tandis qu’en enlever trop endommage les terminaisons nerveuses. L’utilisation d’une jeune souris minimise l’adhérence entre les couches cutanées antérieures et postérieures et la difficulté d’enlever le cartilage sous-jacent. Ces deux éléments augmenteront la probabilité de voir une coloration réussie.

Chaque préparation de peau peut être coupée en deux de l’apex à la base, afin de maximiser le nombre de réplicants et de minimiser les animaux utilisés. Cette section décrit comment colorer les tissus avec FM1-43, mais il devrait fonctionner avec la plupart des autres colorants de styrylpyridinium de cette classe avec un ajustement approprié aux concentrations. Effectuez cette procédure avec des niveaux minimaux de lumière ambiante.

Avant de commencer, préparez suffisamment de 10 micromolaires fraîches FM1-43 dans la solution saline physiologique gazée appropriée pour 3 millilitres par préparation. Mettez chaque préparation dans un plat séparé de 35 millimètres doublé de silicone, avec 2 millilitres de solution saline appropriée. Pour comparer la capacité du calcium et du baryum à maintenir l’absorption du colorant, incubez dans des plats séparés à partir de ce point.

Mettez-en certains dans du calcium normal de 2 millimolaires de Liley et d’autres dans celui de Liley où le baryum remplace le calcium. Ensuite, placez les préparations de plats ouverts sur une plate-forme légèrement immergée dans un bain-marie à 30 degrés Celsius. La profondeur de l’eau doit être suffisante pour réchauffer les mouchoirs sans se déverser dans le plat.

Dans chaque plat, épinglez une fine conduite de gaz sur la base en silicone pour gazer les préparations à environ 10 bulles par seconde. Réchauffez également les solutions FM1-43 et 100 millilitres de solution saline sans colorant dans des bouteilles bien bouchées. Laissez tout s’équilibrer à 30 degrés Celsius et, après 30 minutes, remplacez la solution saline sans colorant sur le tissu en utilisant la solution réchauffée appropriée.

Incuber pendant 30 minutes supplémentaires. Après l’incubation, versez la solution saline sans colorant et épongez rapidement et soigneusement tout liquide restant autour de la préparation. Veillez à ne pas toucher les surfaces dermiques exposées.

Remettez les préparations dans le bain-marie, en maintenant les conduites de gazage en place tout au long de la cuisson. Ajoutez maintenant 2 à 3 millilitres de solution de colorant chaud contenant du calcium ou du baryum. Après 40 minutes, remettez les tissus à température ambiante pour le reste de la procédure, afin d’inhiber la relibération du colorant internalisé.

Maintenant, retirez le colorant non internalisé en trois étapes : Tout d’abord, versez la solution de marquage et rincez rapidement les tissus trois fois avec une solution saline à température ambiante en succession rapide, puis laissez-les incuber pendant 30 minutes pour départager la majeure partie du colorant restant des membranes de surface. Enfin, éliminez le colorant persistant collé à la notice externe des membranes exposées en chélant la préparation avec un dérivé sulfoné de la b-cyclodextrine, composé d’une solution saline de calcium ou de baryum selon le cas. Ainsi, tout le colorant restant se trouvera à l’intérieur des tissus.

Après la chélation, remettez les préparations dans la solution saline fraîche sans colorant appropriée et séchez soigneusement l’extérieur de la vaisselle avec du papier de soie. Ensuite, imagez-les dès que possible. Continuez à fonctionner sous une lumière ambiante minimale.

Avant l’imagerie, à l’aide d’un stéréomicroscope, retirez les débris de surface qui pourraient s’auto-fluorer et contaminer les images. Ensuite, placez la parabole sous un microscope à épifluorescence droit avec un ensemble de filtres à fluorescéine standard. Ensuite, atténuez l’intensité de la lumière d’excitation à l’aide de filtres à densité neutre jusqu’à ce que la préparation soit éclairée juste assez pour localiser confortablement les terminaisons nerveuses.

Un éclairage complet tuera les terminaisons nerveuses assez rapidement. Une fois localisé, capturez des images des terminaux lancéolés étiquetés à l’aide d’un objectif sec 10x ou d’un objectif à immersion dans l’eau 20x. Minimisez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition en utilisant un temps d’intégration de l’appareil photo de 1/2 à 1 seconde.

Pour chaque préparation, imagez environ 20 terminaisons lancéolées, en commençant par la marge la plus éloignée du bord coupé de la base de la peau du pavillon, et en travaillant le long de cette marge, en imageant chaque follicule à tour de rôle. Travaillez dans des champs qui se chevauchent légèrement, parallèlement au bord de la coupe, sans imager deux fois le même follicule ou imager les follicules manifestement endommagés. Après avoir terminé la bande marginale, déplacez-vous d’une largeur de champ vers la base du pavillon et répétez le processus dans le sens inverse.

L’analyse est décrite dans le protocole texte. Après avoir imagé la première boîte, montrant les follicules marqués dans une solution saline contenant du calcium, imagez les follicules dans une solution saline contenant du baryum. Continuez de cette manière.

Assurez-vous que l’imagerie des tissus témoins et expérimentaux restants est adaptée dans le temps, car après le marquage, le colorant sera ensuite libéré à nouveau par le bras d’exocytose du recyclage constitutif du SLV. Dans une préparation typique de pavillon, les follicules pileux sont facilement visibles sous transillumination sans fluorescence, illustrant la nature très mince de la préparation et la relative facilité d’accès qu’elle offre à ces terminaux mécanosensoriels. Sous épifluorescence, les terminaisons lancéolées marquées entourant chaque follicule pileux sont clairement visibles et montrent l’absorption spontanée généralement robuste de FM1-43.

Le motif ponctué reflète les terminaisons observées dans un plan optique orthogonal à la peau, sur toute la longueur de la terminale. L’une des nombreuses applications de cette méthode est l’étude de la cinétique d’exocytose. Comme prévu, si l’absorption de colorant est due au recyclage des vésicules, dans les panneaux supérieurs, une borne étiquetée se détache spontanément.

Après l’application d’un puissant stimulant de l’exocytose, l’alpha-latrotoxine, le processus naturel de décoloration est accéléré, comme on le voit dans les deux panneaux inférieurs. Une autre application, comme observé dans la vidéo, est d’examiner la dépendance calcique de l’endocytose. Une absorption distincte de colorant a été observée pour les terminaisons lancéolées dans les salines contenant du calcium et du baryum.

En quantifiant l’intensité de fluorescence de l’étiquetage terminal observé pendant la vidéo, aucune différence significative n’a été observée dans l’absorption du colorant. Cela indique que l’endocytose est soutenue aussi bien par le baryum que par le calcium. D’autres répétitions de la procédure sur d’autres préparations d’oreille testeront cette conclusion.

Une fois maîtrisés, l’ensemble de ce protocole et de cette imagerie peuvent être réalisés en deux heures et demie. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser de petites souris, de disséquer rapidement et d’être adapté au maximum à l’obscurité pour minimiser l’intensité de la lumière requise. Nous avons adapté l’idée de cette méthode à partir d’une méthode développée à l’origine par un collègue proche et professeur maintenant à la retraite, Clarke Slater, et son étudiant à la maîtrise Michael Caine.

Lorsque nous leur avons parlé du rôle possible des vésicules synaptiques dans la mécanosensation dans le fuseau musculaire, mais de la nécessité d’une meilleure façon de visualiser qu’avec FM1-43. Cette procédure peut également être utilisée en combinaison avec d’autres méthodes, telles que la pharmacologie et l’électrophysiologie. Ensuite, nous pouvons étudier comment le recyclage des vésicules synaptiques est régulé, et comment cela est lié à la réactivité des terminaisons mécanosensorielles.