Name: Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir dembryons de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez à isoler des cellules uniques à partir d'embryons de poisson zèbre pour analyser l'expression génique individuelle. Cette méthode microfluidique révèle l'hétérogénéité cellulaire masquée dans les approches populationnelles classiques.

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Nous remercions le Dr C. Geoffrey Burns pour le stock de poissons. Les auteurs sont reconnaissants à l’UNC Flow Cytometry Core Facility, à l’UNC-CGIBD AAC pour les ressources qui ont permis ce projet, et à l’installation ZAC pour les soins aux animaux. L.S. est soutenu par la subvention NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. est soutenu par la bourse de recherche supérieure NSF NSF-DGE-1144081. Cette étude a été financée par la subvention P30DK034987 des NIH (à UNC Advanced Analytics Core), la subvention de développement scientifique 13SDG17060010 de l’American Heart Association et la subvention de New Scholar de la Fondation Ellison Medical AG-NS-1064-13 (au Dr Qian) et la subvention HL109079 R00 du NIH (au Dr Liu).

<ol><li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis%3A+toward+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+genomics%3A+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126(2014).</li>
<li>Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li>
<li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li>
<li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity%3A+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+early+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644(2014).</li>
<li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+non-detects+in+qPCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).</li>
<li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li>
<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le procédé décrit ici utilise l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente sous le contrôle d&#39;un promoteur spécifique de type cellulaire pour enrichir une population de cellules souches cardiaques à partir d&#39;embryons de poisson zèbre pour une utilisation dans microfluidique système assisté de capture de cellule unique pour évaluer l&#39;expression d&#39;un sous-ensemble de gènes cardiaques en simple cellules. À condition que FACS excitation laser et d&#39;émission de capacités sont compatibles avec le fluoro...

La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l&#39; expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes 1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cellules progénitrices sont souvent sous - représentées, ce qui rend difficile de détecter les changements subtils dans l&#39; expression des gènes qui déclenchent finalement les décisions du destin cellulaire 3. De même, un seul type de cellule peuvent avoir des profils d&#39;expression différents en réponse au microenvironnement 4. Par exemple, les cellules endothéliales résidentes dans le même organe ou dans différents organes (par exemple., De l&#39; aorte ou des reins) présentent une hétérogénéité significative malgré le partage MORP communhological caractéristiques fonctionnelles et 5. En outre, les cellules cancéreuses qui peuplent la même tumeur peuvent également avoir des profils variés ou des mutations moléculaires au niveau cellulaire unique 6. Dans des systèmes modèles, transcriptomique dans des cellules individuelles a réussi à identifier de nouvelles populations de cellules, caractérisé par des états intermédiaires qui se produisent au cours de la différenciation cellulaire, et ont révélé des réponses cellulaires à des stimuli différentielles 7,8,9. Ces idées auraient été masqués dans des études basées sur la population classiques. embryons de poisson zèbre sont une source extrêmement sous-utilisées de la tige, progéniteurs et la différenciation des cellules pour explorer des questions d&#39;hétérogénéité cellulaire unique et la régulation moléculaire des identités cellulaires au cours du développement. Leur très stéréotypée, ex vivo le développement et la facilité de manipulation génétique font un excellent système modèle pour cette approche 10,11. Plus précisément, une limitation majeure à l&#39;interprétation de la cellule unique genles données e d&#39;expression est que l&#39; identification fiable des nouveaux états de cellules intermédiaires au cours du développement exige une synchronisation très prudent de la collecte des tissus 9. Cela est nécessaire pour assurer que l&#39;hétérogénéité entre les cellules capturées représente l&#39;hétérogénéité au sein d&#39;un tissu à un seul point du temps plutôt que de l&#39;hétérogénéité dans l&#39;expression des gènes présenté par la différenciation des cellules dépendant de l&#39;âge. Par rapport à des souris, le développement de l&#39; embryon de poisson zèbre peut être précisément synchronisée à travers un grand nombre d&#39;embryons 12. En outre, avec les grandes tailles d&#39;embrayage, les embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés comme une source abondante de cellules souches et progénitrices. Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules à partir d&#39;embryons de poisson zèbre et de capturer des cellules individuelles en utilisant un circuit de microfluidique intégré (IFC) puce et autoprep système disponible dans le commerce pour qRT-PCR analyse de l&#39;expression génique. Ce protocole peut être rapidement cessible à tous les essais à haut débit de multiplexage, y compris touteséquençage du transcriptome qui permet une analyse plus complète de l&#39; hétérogénéité cellulaire 13. Il offre également plusieurs avantages aux essais traditionnels d&#39;expression génique. Le protocole d&#39;isolement d&#39;une cellule unique donne une viabilité élevée après FACS, ce qui diminue la proportion de cellules compromis qui sont inclus dans les applications en aval. En utilisant un CFI, les cellules capturées peuvent être directement observées pour évaluer les taux de capture et d&#39;évaluer la santé des cellules morphologiquement. En outre, ce protocole est largement applicable à la communauté de recherche zebrafish, exigeant seulement une ligne de poissons transgéniques étiquetés et l&#39;accès aux technologies de capture de cellules microfluidiques. Comme preuve de principe, des cellules individuelles dérivées de progéniteurs cardiaques ont été isolés et capturés sur une puce IFC, puis l&#39;abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été mesurée par qRT-PCR. l&#39;analyse de l&#39;expression génique au niveau de la cellule unique démontre que progéniteurs cardiaques coexistent avec leur différeprogéniture ntiating. L&#39;idée tirée de profilage à cellule unique de progéniteurs cardiaques peut faire la lumière sur l&#39;hétérogénéité des profils d&#39;expression génique entre les cellules progénitrices cardiaques au cours du développement des vertébrés, qui peuvent avoir été masqués dans les analyses basées sur la population traditionnelle.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Pour l’ablation du chorion des embryons Tube de</td></tr><tr><td>microcentrifugation 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules de 40 um</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS surmontés d’une crépine de cellule de 35 um</td><td>Falcon</td><td>352235</td> P1000 et pointes Rainin 17005089 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 et pointes</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>protocole du fabricant de la puce IFC</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 a été utilisé dans une expérience représentative</td></tr><tr><td>Verre pastuer à large alésage pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Pour transfert d’embryons</td></tr><tr><td>Poisson zèbre sauvage adulte</td><td>N/A</td><td></td><td>Nous avons utilisé la lignée AB</td></tr><tr><td>Poisson zèbre transgénique adulte</td><td>N/A</td><td></td><td>Nous avons utilisé Tg(nkx2.5 :ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Réactifs pour la dissociation cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double distilled water</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant</td> Ocean <td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>faire du stock dans l’eau et l’utiliser pour le tampon de déjoutage</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>faire du stock dans l’eau et l’utiliser pour le tampon de déjoutage</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>faire stock dans l’eau et utiliser pour le tampon de déjoutage</td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Chaleur inactivée ; toute marque de FBS doit être fine</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Stocker -20 ; décongeler sur de la glace ; amener à température ambiante avant utilisation</td></tr><tr><td>pronase (facultatif)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Toute coloration vivante/morte adaptée à la cytométrie en flux fonctionnera</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td> réactifs pour l’utilisation de plaques IFC et de sondes</td> spécifiques à qRT-PCR<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene</td> Les <td>sondes varieront selon l’expérience</td>TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs répertoriés dans le protocole</td><td></td><td></td><td></td>IFC du fabricant</tr><tr><td>C1 Kit de réactifs</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Réactifs pour le chargement de cellules sur une plaque IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Réactifs pour les étapes de transcription inverse et de préamplification</td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Qualité Eau</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC pour PréAmpli (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>Plaque IFC pour petites cellules</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Machine AutoPrep</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Pour l’utilisation d’un hémocytomètre sur plaque IFC</td></tr><tr><td>.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Pour le comptage des cellules et l’évaluation</td></tr> de la taille <tr><td>des cellules Microscope</td><td></td><td></td> de dissection <td>Pour le prélèvement d’embryons du chorion</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> de culture tissulaire <td>Pour l’évaluation de la digestion de cellules uniques</td></tr><tr><td>Machine</td><td></td><td></td> FACS <td>Pour l’isolement des cellules d’intérêt</td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un organisme modèle puissant pour étudier le développement des vertébrés. Bien que de nombreux aspects du développement embryonnaire du poisson-zèbre aient été décrits au niveau morphologique, on sait peu de choses sur la base moléculaire des changements cellulaires qui se produisent au fur et à mesure que l’organisme se développe. Grâce aux progrès récents de la microfluidique et des technologies de multiplexage, il est maintenant possible de caractériser l’expression des gènes dans des cellules uniques. Cela permet d’étudier l’hétérogénéité entre les cellules individuelles de populations cellulaires spécifiques afin d’identifier et de classer les sous-types cellulaires, de caractériser les états intermédiaires qui se produisent lors de la différenciation cellulaire et d’explorer les réponses cellulaires différentielles aux stimuli. Cette étude décrit un protocole permettant d’isoler des cellules uniques viables à partir d’embryons de poisson-zèbre pour des tests de multiplexage à haut débit. Cette méthode peut être rapidement appliquée à tout type de cellule embryonnaire de poisson-zèbre avec des marqueurs fluorescents. Une extension de cette méthode peut également être utilisée en combinaison avec des technologies de séquençage à haut débit pour caractériser complètement le transcriptome de cellules uniques. Comme preuve de principe, l’abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été évaluée dans des cellules uniques isolées dérivées de progéniteurs cardiaques positifs nkx2.5. En évaluant l’expression génique au niveau de la cellule unique et à un seul point temporel, les données soutiennent un modèle dans lequel les progéniteurs cardiaques coexistent avec une descendance différenciante. La méthode et le flux de travail décrits ici sont largement applicables à la communauté de recherche sur le poisson-zèbre, ne nécessitant qu’une lignée de poisson transgénique étiquetée et un accès aux technologies de microfluidique.

Comme preuve de principe, l&#39;expression des gènes a été évaluée pour explorer la dynamique de différenciation au cours du développement cardiaque. Chez le poisson zèbre, les progéniteurs cardiaques proviennent d&#39;une population mésodermique de cellules qui migrent vers la plaque latérale mésoderme antérieure où ils fusionnent pour former le tube cardiaque linéaire. Avant la fusion, les progéniteurs cardiaques commencent à exprimer le Nkx2.5 facteur de transcription (NK2 ho...

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

L'objectif général de cette expérience est d'isoler des cellules individuelles à partir d'embryons de poisson zèbre à un stade précoce afin de les capturer dans un système multiplexe de cellule unique basé sur la microfluidique, dans le but d'évaluer l'expression génique de cellules individuelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que les changements transcriptionnels que subissent les cellules durant la spécification et la différenciation. Le principal avantage de cette technique réside dans son approche impartiale permettant de révéler l'hétérogénéité masquée par les techniques conventionnelles basées sur des populations cellulaires.En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront des difficultés, car la préparation de cellules individuelles viables est techniquement exigeante mais essentielle pour les analyses en aval. Une fois maîtrisée, la transformation d'échantillons d'embryons entiers en cellules individuelles lysées sur une puce microfluidique intégrée peut être réalisée en six heures, à condition que les étapes soient correctement exécutées. Lors de la réalisation de cette pro

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Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Somitogenèse est un processus de développement rythmique que spatialement modèles les axes de corps d'embryons de vertébrés. Auparavant, nous avons développé des lignes de poisson zèbre transgénique qui utilisent journalistes fluorescentes pour observer les gènes cycliques qui animent ce processus. Ici, nous avons la culture dispersés cellules de ces lignes et l'image de leurs oscillations dans le temps in vitro.

Génération d&#39;dispersée présomitique mésoderme cultures cellulaires pour l&#39;imagerie de la segmentation Horloge poisson zèbre dans des cellules individuelles

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée...

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Nous présentons un protocole efficace et facile à utiliser pour la préparation de cultures de cellules primaires d’embryons de poisson-zèbre pour la transfection et l’imagerie de cellules vivantes, mais aussi un protocole pour préparer les cellules primaires du cerveau adulte poisson-zèbre.

Culture et la Transfection des cellules primaires de poisson-zèbre

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Le présent protocole décrit l’isolement aigu de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires viables provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires (Danio rerio), adaptés aux études électrophysiologiques.

Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.

Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

Apprenez à isoler des cellules uniques à partir d'embryons de poisson zèbre pour analyser l'expression génique individuelle. Cette méthode microfluidique révèle l'hétérogénéité cellulaire masquée dans les approches populationnelles classiques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre

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