Synthèse des bioconjugués protéiques via Cystéine-maléimide Chemistry

L’objectif global de la synthèse de bioconjugués protéiques par la chimie cystéine-maléimide est d’assurer la spécificité du site de modification sur la protéine. Ce qui à son tour affecte l’activité du bioconjugué résultant, par exemple, les conjugués anticorps-médicament. Si vous vous intéressez à la structure ou à la fonction des protéines et que vous faites des recherches en nanomédecine, en microscopie fluorescente ou en chimie des systèmes, cette technique vous aidera à répondre à vos questions.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très spécifique et qu’elle offre un rendement élevé dans plus de conditions. Pour commencer cette procédure, dissolvez 12 milligrammes de cytochrome C lyophilisé dans six millilitres de tampon de phosphate 20 millimolaires. Pipetez 16 microlitres d’une solution molaire de DTT fraîchement préparée dans la solution protéique pour réduire le cytochrome C.Après avoir mélangé la solution, filtrez-la à travers un filtre à seringue PBDF à faible liaison protéique de 0,22 micron avant de l’injecter sur n’importe quel support chromotographique.

Ensuite, purifier la solution brute réduite de cytochrome C par chromotographie liquide rapide des protéines ou FPLC. Après avoir équilibré une colonne étrange fortement cationique, chargez un millilitre de solution dans la boucle d’injection de l’instrument. Ensuite, commencez une méthode de gradient à partir de 328 pour 450 millimolaires de chlorure de sodium, sur cinq volumes de colonne.

Surveillez les canaux de 280 et 410 nanomètres du détecteur UV viz et collectez le plus grand pic. Augmentez maintenant la concentration de sel à une molaire pour deux volumes de colonne afin de récupérer le cytochrome C ISO2.Après que la colonne a été rincée, rééquilibrez avec deux volumes de colonne de tampon de phosphate de 20 millimolaires avant d’injecter l’aliquote brute suivante. À ce stade, dissolvez 0,9 milligramme du complexe de maléimide de ruthénium approprié dans 600 microlitres d’acétonitrile.

Préparez une solution de PTCE de 10 millimolaires en dissolvant 2,87 milligrammes de PTCE dans un millilitre d’eau ultra-pure. Mélangez 11,4 millilitres d’eau ultra-pure, trois millilitres d’une solution mère de phosphate-EDTA de 100 millimolaires dans un tube en plastique de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 0,15 micromole de cytochrome C purifié à la solution de phosphate-EDTA.

Ajouter 7,5 microlitres de la solution mère de PTCE à la solution protéique. Et laissez remuer pendant cinq minutes pour réduire toute protéine qui pourrait s’être dimérisée en raison de l’oxydation de la cystéine. Ajoutez ensuite 600 microlitres de la solution du complexe maléimide de ruthénium à la solution réduite de cytochrome C tamponné, et laissez le mélange réactionnel remuer dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 heures.

L’ordre d’addition est de la plus haute importance. Il est essentiel d’ajouter d’abord la protéine, puis l’agent réducteur et enfin le maliémide. Le lendemain, concentrer le mélange réactionnel par centrifugation à l’aide d’un filtre de centrifugation de 3,5 kilodaltons de poids moléculaire

Répétez la centrifugation deux à trois fois avec un tampon de phosphate frais de 20 millimolaires jusqu’à ce que le filtrat soit clair. Pour la purification à base de nickel, lavez un millilitre de colonne de chromotographie d’affinité métallique mobilisée avec trois millilitres d’eau ultra-pure, trois millilitres de solution d’acétate de nickel de 100 millimolaires et six millilitres d’eau ultra-pure. Ensuite, fixez la colonne chargée de nickel au FPLC entre la boucle d’injection et le détecteur UV-Viz.

Ensuite, équilibrez la colonne avec trois volumes de colonne de 20 millimolaires de phosphate et de 0,5 molaire de chlorure de sodium en utilisant un débit de 0,5 millilitre par minute. Après avoir filtré à travers un filtre à seringue de 0,22 micron, chargez 100 microlitres du mélange réactionnel brut dans la boucle d’injection de l’instrument. Lavez la colonne avec trois volumes de colonne de tampon pour éluer le cytochrome C n’ayant pas réagi, puis éluez le bioconjugué du cytochrome C à l’aide d’un gradient d’imidazole de zéro à 125 millimolaires sur trois volumes de colonne.

Une fois que le bioconjugué du cytochrome C s’est échappé de la colonne, laver avec un tampon d’imidazole de 250 millimolaires pour cinq volumes de colonne. Rééquilibrez ensuite la colonne avec 20 tampons de chlorure de sodium 0,5 molaire de phosphate millimolaire. Ensuite, tirez les fractions bioconjuguées.

Et concentrer par centrifugation à l’aide d’un filtre de spin de coupure de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons. Après la centrifugation, chargez le bioconjugué concentré dans des cassettes de dialyse de 3,5 kilodaltons de poids moléculaire coupé et dialysez contre de l’eau ultra-pure pendant la nuit. Le lendemain, déterminer la concentration de la solution bioconjuguée pure et concentrée par spectroscopie UV-Vis.

En utilisant la même valeur d’absorbtivité molaire que le cytochrome C ISO1 à 410 nanomètres. Stockez le bioconjugué restant sous forme d’aliquotes de 25 microlitres à moins 20 degrés Celsius. Pour l’électrophorèse sur gel, préparer 10 microlitres de chaque échantillon de protéine à analyser en diluant le bioconjugué avec un tampon de dodécylsulfate de lithium prémélangé jusqu’à une concentration finale d’environ 20 microgrammes par puits.

Ensuite, chauffez les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir laissé refroidir les échantillons à température ambiante, chargez-les soigneusement sur un tris pré-moulé à 12 % bis, un gel millimètre à 10 puits à l’aide de longues pointes de pipette pour faciliter le chargement. Chargez un marqueur de poids moléculaire de 10 protéines pré-coloré dans un puits central du gel pour faciliter l’analyse.

Faites maintenant fonctionner le gel à 200 volts pendant 35 minutes. Une fois la course terminée, colorez le gel avec une solution commerciale de bleu Coomassie pendant deux heures. Après avoir retiré la solution bleue de Coomassie, lavez le gel à l’eau ultra pure pendant 48 heures.

Une augmentation de masse en l’absence de protéine n’ayant pas réagi dans le spectre de masse multi tof du bioconjugué du cytochrome C a démontré la liaison équivalente réussie du complexe maléimide de ruthénium au cytochrome C. Le rendement du bioconjugué du cytochrome C est généralement compris entre 15 et 27 % et peut être calculé à partir du spectre UV-Vis. Le bioconjugué consiste en une fixation individuelle du maléimide à la protéine.

Ce qui est déduit en comparant le spectre du bioconjugué à un spectre d’addition prédit des matériaux de départ. De plus, l’apparition d’un nouveau pic dans le chromatogramme lors de la purification confirme la synthèse d’une nouvelle espèce. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en trois jours si elle est effectuée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de traiter soigneusement vos solutions protéiques à l’aide de gants pour éviter l’introduction de protéines dans vos échantillons. Cette procédure peut être utilisée pour la conjugaison d’autres maléimides à des protéines contenant de la cystéine. Afin de répondre à des questions supplémentaires, comme si la protéine membranaire se trouve dans une membrane de protozoaire vivant.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine biomoléculaire pour mieux comprendre la fonction et la localisation des protéines dans les contraintes viscales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la chimie de la cystéine maléimide afin de marquer des biomacromolécules à haut rendement. N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques de recherche aux propriétés inconnues peut être extrêmement dangereux.

Et que des précautions appropriées, telles que l’utilisation d’un EPI, doivent être prises lors de l’exécution de cette procédure.