Name: Le nerf fibulaire Méthode Blessure: Un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparation neuromusculaires Jonctions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Découvrez une méthode chirurgicale fiable pour étudier la réinnervation musculaire et la régénération des jonctions neuromusculaires chez la souris. Cette technique permet de comparer les taux de régénération entre groupes expérimentaux avec une grande reproductibilité.

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Les auteurs remercient les membres du laboratoire Valdez pour leur contribution intellectuelle aux expériences et leurs commentaires sur le manuscrit.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du NIH et des protocoles d&#39;animaux approuvés par le Comité Tech soin et l&#39;utilisation des animaux institutionnels Virginie. 1. Préparer les animaux destinés à la chirurgie <ol><li> Anesthésier les souris avec un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) par injection sous-cutanée inguinale avec une seringue de 1 ml d&#39;insuline stérile. solution véhiculaire contient un mélange d&#39;une solution saline à 0,9%, 17,4 mg / ml de kétamine et de 2,6 mg / ml de xylazine. Placez les animaux de retour dans des cages en attendant des médicaments à prendre effet. REMARQUE: si la dose de charge ne fournit pas une anesthésie suffisante pour la durée de la procédure, un supplément de 25% la dose de charge peut être injectée. </li><li> animaux Surveiller après l&#39;injection pour vérifier les taux respiratoires stables et la dépression appropriée des niveaux d&#39;excitation. Vérifier le niveau d&#39;excitation avec une pincée de pied arrière, ce qui devrait susciter aucune réponse lorsque suffisamment anesthésiés. NOTE: Cela prend habituellement 3-5min pour une souris adulte jeune en moyenne 25 à 30 g. Si l&#39;animal est encore sensible après l&#39;injection de poste de 10 min, 25% supplémentaires de la dose de charge anesthésique peut être injecté. </li><li> Appliquer la vaseline et l&#39;huile minérale légère pommade ophtalmique aux yeux de l&#39;animal pour prévenir la sécheresse. Retirer les animaux de la cage et la placer sur une surface plane et propre. Rasez la patte postérieure souhaitée du pied à l&#39;aide d&#39;un bassin tondeuse électrique, exposant seulement la face latérale de la branche. </li><li> Appliquer un épilateur chimique sur le site rasé pendant 1 min. Supprimez manuellement les cheveux en utilisant des lingettes de laboratoire. Nettoyer la zone épilée avec le laboratoire lingette trempé dans l&#39;éthanol. </li></ol> 2. Procédure chirurgicale <ol><li> Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclave ou autre méthode appropriée. Nettoyer le site chirurgical et planche chirurgicale avec 80% d&#39; éthanol / H 2 0. Désinfecter le site chirurgical avec proviodine. Placez la souris à bord chirurgical et aligner les restrictions des membres. Garderle membre cible postérieur dans une position anatomique naturelle avec l&#39;articulation du genou légèrement prolongé sans rotation interne ou externe. </li><li> Placez l&#39;animal et planche sous le microscope chirurgical. Orient sur le site d&#39;incision correcte via la palpation des repères superficiels, en particulier l&#39;articulation du genou osseux et la crête entre le jambier antérieur et les muscles gastrocnémiens. </li><li> Faire une incision d&#39;environ 3 cm à travers la peau à l&#39;aide d&#39;un scalpel ou des ciseaux de printemps tout en utilisant une pince de préhension générales. Faire l&#39;incision perpendiculaire à la couche sous-jacente du nerf fibulaire commun. </li><li> Continuer l&#39;incision à travers l&#39;aponévrose superficielle, exposant le biceps fémoral et vaste externe muscles. Séparer ces muscles en coupant à travers le fascia profond de connexion. A 1-2 cm coupe doit être suffisante. </li><li> Rentrez muscle biceps fémoral en utilisant caudale enrouleurs mécaniques, révélant le nerf fibulaire commun. </li><li> Tracez le nerf proximalement jusqu&#39;à son intersection avec le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien est trouvé. Remarque: L&#39;exposition peut nécessiter une manipulation supplémentaire de la peau rétractée et musculaire. Cette intersection est utilisée comme point de repère stable pour la lésion nerveuse. </li><li> Saisir le nerf avec une pince fine, en alignant les conseils d&#39;une manière parallèle à la bordure latérale du tendon gastrocnémien. Écraser le nerf fibulaire commun en appliquant une forte pression constante pendant 5 sec. </li><li> Corroborer pleine écrasement du nerf par inspection visuelle à travers le champ chirurgical. Il apparaît translucide au site de la lésion. Si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques, la fluorescence disparaît du site de la lésion. </li><li> Retirer écarteurs et réaligner les muscles dans leurs positions anatomiques. Fermez le site d&#39;incision avec 6-0 sutures de soie. 1-3 simples sutures interrompues est suffisante. Placez la récupération de la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre. </li><li> Surveiller tous les animaux pendant 2 heures post-opération pour vérifier la respiration et les réactions indésirables à l&#39;anesthésie. Administrer une dose initiale de buprénorphine 0,05-0,10 mg / kg par injection sous-cutanée inguinale immédiatement après récupération de la chirurgie. Donner 3 doses supplémentaires chaque 12 h sur 48 h suivant. Après un rétablissement complet, le retour des souris à l&#39;établissement de soins des animaux. </li></ol> 3. Isolement et Coloration des extensor digitorum longus (EDL) Muscles <ol><li> Sacrifiez les animaux en utilisant l&#39;isoflurane. Distribuer 0,5 ml d&#39;isoflurane liquide dans un tube de 50 ml remplie de labwipes absorbants. Placer le tube non coiffé avec l&#39;animal dans une enceinte étanche 2 500 cm 3. Au moins 4 min d&#39;exposition est suffisante. Test de perte de palpébrale bilatérale, toe-pincement, et des réflexes queue-pincement pour veiller à ce que chaque animal est inconscient avant de procéder à la perfusion. </li><li> Perfuser transcardiaque 16 animaux d&#39; abord avec 10 ml de PBS 0,1 M, puis 25 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS 0,1 M (pH 7,4). Héparine (30 unités / 20g poids de l&#39;animal) peut être ajouté avec le PBS (10 unités / ml) pour empêcher la coagulation du sang dans les petits lits capillaires, améliorant ainsi les résultats de la perfusion. </li><li> Retirer la peau qui recouvre les membres postérieurs en utilisant des ciseaux pour couper transversalement à travers la peau autour de la circonférence de l&#39;abdomen. Peler la peau vers le bas devant les membres et les pieds postérieurs en utilisant une pince. </li><li> Retirer aponévrose superficielle des membres postérieurs en saisissant et le pelage avec une pince. Si en utilisant des souris exprimant des protéines fluorescentes dans les axones périphériques, post-fixer des souris toute la nuit dans 4% PFA dans 50 ml tubes. Rinçage trois fois avec du PBS. NOTE: Des souris fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C. Sinon, ignorez cette étape et passez à l&#39;étape 3.6 sans animaux de post-fixation. </li><li> Disséquer muscles EDL 18 de membres postérieurs de la souris, en étant sûr de garder proximale et distale tendons aussi intact que possible. </li><li> Incuber muscles EDL dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 0,5% de Triton X-100, 3% de BSA et du sérum de chèvre à 5%) pendant au moins 1 h. </li><li&gt; Pour visualiser les axones moteurs et leurs terminaisons nerveuses, placer les muscles dans des tubes contenant neurofilament (1: 1000) et synaptotagmin-2 (1: 250) anticorps dilué dans un tampon bloquant pendant 3 jours. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. Remarque: Passer cette étape si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence (XFP) dans les axones périphériques. </li><li> Colorer le controlatéral indemne EDL comme un contrôle positif pour toutes les innervation NMJ. Les contrôles négatifs devraient inclure une liste EDL obtenue à 4 jours après la lésion, un point de temps où le NMJ est complètement dénervé, ainsi qu&#39;une EDL colorées avec un anticorps secondaire. </li><li> Incuber muscles avec des anticorps secondaires appropriés marqués par fluorescence pour détecter neurofilament et synaptotagmin-2 pour 1 jour. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. Remarque: Cette étape peut être effectuée en même temps que l&#39;étape 3.10. Passer cette étape si en utilisant des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques. </li><li> Pour visualiser le postsynaptic région de la jonction neuromusculaire, incuber les muscles avec 5 pg / ml Alexa-555 alpha-bungarotoxine conjugué dilué dans du tampon de blocage pendant au moins 2 heures. Laver les muscles trois fois avec PBS 1x et 10 min à chaque fois. </li><li> Pour monter les muscles entiers sur des lames de verre chargées positivement, placez le muscle directement sur la diapositive, ajouter quelques gouttes de glycérine à base moyen sur la glissière de montage et couvrir avec une lamelle. Appuyez sur la lamelle contre la glissière pour aplatir le muscle. Tremper hors milieu de montage à partir du périmètre des lingettes de laboratoire lame et lamelle en utilisant. Appliquer le vernis à ongles pour sceller les bords entre la lamelle et un toboggan. </li></ol> 4. Imagerie et analyse des données <ol><li> Pour analyser la structure de NMJs, l&#39;image du muscle EDL en utilisant un microscope à balayage laser confocal équipé pour exciter 488, 555 et 633 nm de lumière et de capturer la lumière émise avec 20X et 40X objectifs. </li><li> Pour visualiser l&#39;ensemble NMJs, créer un maximum d&#39;images de projection d&#39;intensité de sec optiquetions espacés de 1 à 2 pm étendant à part la plus faible dans les régions les plus élevées visibles de la NMJ. Créer des projections d&#39;intensité maximale disponible dans le commerce en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Pour déterminer les taux de réinnervation, classer NMJs comme: 1) complètement dénervé = le site postsynaptique est complètement dépourvu de contact avec axone, moins de 5% colocalisation entre l&#39;axone et AChR. 2) partiellement innervé = l&#39;axone recouvre partiellement la postsynapse, 5-95% colocalisation entre l&#39;axone et AChR. 3) innervation pleine = presque parfaite apposition entre le pré et post-synaptique, plus de 95% colocalisation entre l&#39;axone et AChR. Exclure NMJs qui se situent perpendiculairement au plan de l&#39;image ou ne sont pas entièrement visualisées dans l&#39;image. Nota: Dans toutes ces expériences, au moins 3 animaux et 50 NMJs par animal ont été examinés. Les résultats ont été jugés significatifs en utilisant un test t de l&#39;étudiant avec une valeur de P inférieure à 0,05. </li><li> Pour aveugler l&#39;opérateur, des individus séparés peuvent effectuerla chirurgie et l&#39;analyse d&#39;images. Sans la connaissance des groupes de traitement, l&#39;analyseur peut être objectif avec NMJ notation. Alternativement, les images peuvent être randomisés et présentés à l&#39;opérateur pour l&#39;analyse sans connaissance de l&#39;animal source. </li></ol> 5. PCR quantitative <ol><li> Sacrifiez les animaux en utilisant l&#39;isoflurane et dislocation cervicale. Enlever la peau et le fascia superficiel couvrant les muscles des jambes selon l&#39;étape 3.3. Disséquer jambier antérieur et les muscles EDL selon l&#39;étape 3.4. </li><li> Flash geler l&#39;ensemble du jambier antérieur et les muscles EDL dans un tube de 1,5 ml dans de l&#39;azote liquide. Retirer le tissu du tube et le placer dans un mortier pré-refroidi partiellement immergé dans de l&#39;azote liquide. Broyer le muscle congelé en une fine poudre en utilisant un mortier et un pilon. </li><li> Dissoudre la poudre de muscle congelé dans un réactif d&#39;extraction d&#39;ARN disponibles dans le commerce et d&#39;effectuer l&#39;extraction d&#39;ARN et l&#39;élimination de l&#39;ADN génomique avec un kit disponible dans le commerce selon le constructeur instructions. </li><li> Effectuer la transcription inverse avec un mélange de transcriptase inverse disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. </li><li> Effectuer qPCR en utilisant un kit disponible dans le commerce en utilisant des gènes d&#39;entretien ménager appropriés (voir tableau des matériaux). Utilisez un quantitative cycleur thermique PCR disponible dans le commerce pour effectuer la PCR (voir le tableau des matériaux). </li><li> Régler la température de recuit à 58 ° C. Régler les paramètres de cyclisme supplémentaires aux spécifications du fabricant de Taq polymérase / SYBR vert mix. Inclure une étape finale de la courbe de fusion dans le programme de thermocycleur constitué de 0,5 ° C des augmentations progressives de 65 ° C à 95 ° C pour tester la spécificité d&#39;amorce et amorce la formation du dimère. </li><li> Déterminer les niveaux relatifs d&#39;expression d&#39;ARNm de la 2 - Méthode ΔΔCT 21 en utilisant l&#39; ARN 18S en tant que gène de contrôle. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée dans ce manuscrit offre des occasions uniques pour identifier les mécanismes impliqués dans la réparation des jonctions neuromusculaires (NMJ). Cette méthode consiste à écraser le nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus du tendon gastrocnémien près du genou. Nous montrons que, après seulement 5 secondes de la compression du nerf avec une pince, la dégénérescence complète est noté par 4 jours après une blessure. Chez les souris jeunes adultes, les axones alpha-moteur commencent à reinnervate ...

Chez les jeunes adultes et les animaux en bonne santé, la jonction neuromusculaire (JNM) est une connexion très stable entre la présynapse, la terminaison nerveuse d’un axone α-moteur, et la postsynapse, la région spécialisée d’une fibre musculaire extrafusale où les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (AChR) s’agrègent sélectivement1. L’apposition presque parfaite des appareils pré et post-synaptiques est nécessaire à la bonne neurotransmission, à la survie des neurones α-moteurs et des fibres musculaires et à la fonction motrice. Malheureusement, la fonction de la NMJ est affectée négativement par le vieillissement, des maladies telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), les maladies auto-immunes et les lésions musculaires et nerveusespériphériques 2-5. Ces insultes entraînent souvent une dégénérescence des terminaisons nerveuses présynaptiques, laissant les muscles dénervés et altérant considérablement les capacités motrices. Pour cette raison, l’identification des molécules qui ont pour fonction de maintenir et de réparer la JNM est devenue une priorité. Parce que les nerfs périphériques régénèrent et réinnervent les cibles, des modèles de lésions nerveuses périphériques ont été utilisés pour identifier les changements moléculaires associés à la régénération des JNM. 
Les modèles de lésions nerveuses périphériques impliquent souvent soit la coupe complète, soit l’écrasement de branches nerveuses spécifiques6. À la suite d’une incision, le tube endoneurial doit être reformé, ce qui retarde la régénération axonale et la réinnervation des cellules et des tissus cibles. La gravité de ce type de blessure fait également que les axones s’éloignent de leur trajectoire d’origine, ce qui les empêche d’atteindre leurs cibles initiales. Cela contraste avec les nerfs blessés par écrasement où l’endoneurium reste contigu, offrant une voie pour une repousse efficace et appropriée des axones en régénération. Il permet également aux axones de trouver et de réinnerver leurs partenaires de fibres musculaires d’origine. Quel que soit le modèle de blessure, un certain nombre de changements cellulaires et moléculaires doivent se produire pour que les axones se régénèrent et réinnervent les cibles. Après une blessure, le segment nerveux proximal de la cible est décomposé et éliminé via un processus appelé dégénérescence wallérienne7. Ce processus implique la reprogrammation et la dédifférenciation des cellules de Schwann en cellules non myélinisantes qui sécrètent des facteurs de régénération, éliminent la myéline et recrutent des macrophages sur le site de la lésion8. Les macrophages à leur tour achèvent l’élimination de la myéline et des débris axonaux, qui autrement entraveraient la croissance de l’axone9 en régénération. En parallèle, les neurones moteurs et sensoriels activent les mécanismes nécessaires pour favoriser la régénération de leurs axones sectionnés. Une fois que l’axone en régénération atteint la cible, il doit se transformer d’un cône de croissance en une terminaison nerveuse capable de transmettre correctement (pour les axones moteurs) ou de recevoir (pour les axones sensoriels) des informations10. À cet égard, les axones alpha-moteurs subissent une série de changements bien orchestrés qui culminent dans la différenciation de leur cône de croissance en une terminaison nerveuse présynaptique entièrement fonctionnelle qui s’oppose presque parfaitement au site post-synaptique sur la fibre musculaire cible11. 
Les nerfs sciatique, tibial et accessoire ont été les principaux choix pour étudier la régénération axonale et NMJ12-14. Cependant, l’utilisation de ces modèles pour examiner les changements cellulaires et moléculaires associés à la régénération des JNM entre animaux et dans différentes conditions présente un certain nombre d’inconvénients. Tout d’abord, le nerf sciatique alimente la majorité des muscles du membre postérieur, les blessures limitant considérablement les mouvements et les sensations. Il n’est donc pas possible d’utiliser cette méthode pour étudier l’impact de l’exercice seul ou en combinaison avec d’autres facteurs. De plus, le nerf sciatique est une structure assez épaisse et nécessite donc une grande quantité de force de compression pour blesser complètement tous les axones. Cela peut à son tour entraîner une section complète des axones les plus superficiels tout en laissant intact le tube endoneurial des axones plus profonds, introduisant une variabilité significative dans le taux et la fidélité de la régénération entre ces axones. La section complète de ce nerf est encore moins souhaitable étant donné que de nombreux axones ne parviendront pas à se reconnecter avec les mêmes fibres musculaires. Pour compliquer les choses, le nerf sciatique possède une variabilité anatomique intrinsèque, à la fois dans le nombre et le site d’origine de ses branches nerveuses terminales. Il est donc très difficile de lésionner le même site. Bien que le nerf tibial soit plus petit et plus propice aux blessures par écrasement, il n’y a pas non plus de point de repère facilement disponible pour servir de site de lésion pour cette branche nerveuse. 
La branche nerveuse accessoire (partie du nerf crânien XI) qui alimente le muscle sterno-cléido-mastoïdien a également été utilisée pour étudier la régénération des JNM15. Ce nerf est particulièrement attrayant car les NMJ dans le muscle sterno-cléido-mastoïdien peuvent être plus facilement imagés chez les animaux vivants que les NMJ dans d’autres muscles. Mais comme pour les nerfs sciatique et tibial, il n’y a pas de point de repère spécifique qui peut être utilisé pour blesser ce nerf au même endroit, le limitant comme modèle pour comparer la régénération des JNM entre des animaux individuels d’une cohorte expérimentale. Un site de lésion incohérent introduit une variabilité dans les taux de réinnervation de la JNM. En raison de ces lacunes, la procédure présentée ici utilise la lésion d’une branche nerveuse périphérique différente pour examiner les JNM en régénération. 
Le nerf fibulaire commun, également appelé nerf péronier commun, contient de nombreuses caractéristiques qui en font un nerf fiable pour examiner la régénération des JNM entre animaux et à travers différents traitements. Le nerf fibulaire commun a un parcours anatomique prévisible lorsqu’il passe sur le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien du genou, l’intersection servant de point de repère stable pour les lésions. On accède au nerf par une petite incision peu invasive à proximité des muscles d’intérêt, mais séparée anatomiquement de ceux-ci. Les résultats présentés ici démontrent que les axones moteurs en régénération commencent à reformer les NMJ dans le muscle long extenseur des doigts (EDL) 8 jours après l’écrasement du nerf fibulaire chez des souris femelles jeunes adultes âgées de 70 jours. Il est important de noter que le modèle et le taux de réinnervation sont cohérents chez les animaux du même âge et du même sexe et fournissent donc un modèle de blessure fiable qui accélérera considérablement notre compréhension des changements cellulaires et moléculaires nécessaires au maintien et à la réparation des JNM.

<table><tbody><tr><td>Kétamine</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.</td><td>003437&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>&nbsp ; Zoopharm</td><td>1Z-73000-150910&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir électrique</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80 % EtOH/H20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % Proviodine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue</td><td></td><td></td><td></td>à</tr><tr><td>insuline Ciseaux</td> <td>à ressortVannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>N° 15 scalpel</td><td>Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture en soie sur aiguille de coupe inversée</td><td>&nbsp ; Suture Express</td><td>752B&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant pour rongeurs</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr>Alexa 555 <td>Sondes moléculaires</td><td>conjuguées alpha-BTX</td><td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo zoom Olympus Olympus</td><td></td><td>562037192</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Zeiss 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe de perfusion péristaltique à débit variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Pommade</td> <td>vétérinairePuralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Synaptotagmine-2-En</td><td>ligne</td><td>ABIN401605</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anticorps de neurofilaments-En</td><td>ligne</td><td>ABIN2475842</td><td></td></tr></tbody></table>

le nerf fibulaire méthode blessure: un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparation neuromusculaires jonctions

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

La jonction neuromusculaire (JNM) subit des changements structurels et fonctionnels délétères en raison du vieillissement, les blessures et la maladie. Ainsi, il est impératif de comprendre les changements cellulaires et moléculaires impliqués dans le maintien et la réparation des NMJs. A cet effet, nous avons développé une méthode pour examiner de manière fiable et constante régénération NMJs chez la souris. Cette méthode de lésion du nerf implique l&#39;écrasement du nerf fibulaire commun, car elle passe au-dessus de la tête latérale du tendon du muscle gastrocnémien près du genou. Utilisation de vieilles souris femelles 70 jours, nous démontrons que les axones moteurs commencent à reinnervate cibles postsynaptiques précédents dans les 7 jours après l&#39;écrasement. Ils réoccuper complètement leurs zones synaptiques précédents en 12 jours. Pour déterminer la fiabilité de cette méthode de blessure, nous avons comparé les taux de réinnervation entre 70 jour vieilles souris femelles individuelles. Nous avons constaté que le nombre de sites postsynaptiques réinnervé était similaire entre les souris à 7, 9, et 12 jours après l&#39;écrasement. Pour déterminer sicet essai de lésion peut également être utilisé pour comparer les changements moléculaires dans les muscles, nous avons examiné les niveaux de la sous-unité gamma du récepteur nicotinique musculaire (gamma-AChR) et la kinase spécifique du muscle (MuSK). La sous-unité gamma-RACh et MuSK à sont fortement surexprimés dénervation suivant et revenir à des niveaux normaux après réinnervation des NMJs. Nous avons trouvé une relation étroite entre les niveaux de transcription de ces gènes et de l&#39;état de l&#39;innervation des muscles. Nous croyons que cette méthode permettra d&#39;accélérer notre compréhension des changements cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation de la NMJ et d&#39;autres synapses.

Le nerf fibulaire commun, aussi appelé le nerf fibulaire commun, provient du nerf sciatique au- dessus du creux poplité, où il oscille autour de la tête du péroné à la face antérieure de la jambe (figure 1A). Là, il se ramifie en les nerfs fibulaires superficiels et profonds, fournissant ainsi les dorsiflexors du pied et des orteils (anterior tibial, extensor digitorum longus et brevis et hallux extenseurs muscles des orteils), et les everters du pied (muscles péroniers)...

Nous avons développé une méthode de lésion nerveuse pour examiner de manière fiable la réinnervation musculaire, et donc la régénération des jonctions neuromusculaires chez la souris. Cette technique consiste à lézarder le nerf fibulaire commun via une chirurgie simple et hautement reproductible. La réinnervation musculaire est ensuite évaluée par montage entier du muscle long extenseur des doigts.

Le nerf fibulaire Méthode Blessure: Un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparation neuromusculaires Jonctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

L'objectif général de cette méthode de lésion du nerf périphérique est d'examiner de manière fiable les jonctions neuromusculaires en cours de régénération chez la souris. Cette méthode nous aidera à identifier les modifications moléculaires, cellulaires et fonctionnelles associées à la régénération des jonctions neuromusculaires. Le principal avantage de cette procédure est que la vitesse de régénération de la jonction neuromusculaire peut être comparée de façon fiable entre des groupes expérimentaux, pratiquement en l'absence de modifications myogéniques.La procédure sera démontrée par William Dalkin, un étudiant en médecine de mon laboratoire. Avant de commencer la procédure, utilisez de l'éthanol à 80 % pour nettoyer le site chirurgical, la planche opératoire et les instruments, puis désinfectez avec de la povidone-iodée. Ensuite, placez la souris sur la planche opératoire et vérifiez l'absence de réponse à une pincée des orteils.Aligner les membres dans les attaches avec le membre postérieur cible en position anatomiquement naturelle, les articulations du genou légèrement étendues et sans rotation interne ou externe. Ensuite, transférer l'animal sous un microscope chirurgical et ajuster la planche jusqu'à ce que l'articulation osseuse du genou et la crête entre les muscles tibial antérieur et gastrocnémien soient visibles à travers l'objectif. À l'aide d'un scalpel et de forceps, pratiquer une incision d'environ trois centimètres à travers la peau, perpendiculairement au trajet sous-jacent du nerf fibulaire commun.Poursuivre l'incision à travers la fascia superficielle afin d'exposer les muscles biceps fémoral et vaste latéral, puis pratiquer une incision d'un à deux centimètres à travers le fascia profond conjonctif pour séparer les muscles. Ensuite, utiliser des rétracteurs mécaniques pour écarter caudalement le muscle biceps fémoral et mettre ainsi à nu le nerf fibulaire commun. Suivre le nerf en direction proximale jusqu'à ce que son intersection avec le tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien soit identifiée.Ensuite, utilisez une pince fine pour saisir le nerf en alignant les extrémités parallèlement à la bordure latérale du tendon du muscle gastrocnémien et appliquez une pression constante et concentrée pendant cinq secondes afin de broyer le nerf fibulaire commun. En tenant la pince perpendiculairement à la fibre, saisissez le tissu avec la zone située juste derrière l'extrémité de la pince et appliquez une pression ferme mais douce pour obtenir un broyage net et linéaire du nerf le long de la bordure du tendon. Examinez visuellement le nerf au microscope chirurgical afin de confirmer un broyage complet du tissu.Le nerf apparaîtra translucide au niveau du site de la lésion. Si l'on utilise des souris exprimant des protéines fluorescentes dans les axones périphériques, la fluorescence disparaîtra du site de la lésion. Si le nerf a été suffisamment endommagé, retirez les écarteurs et réalignez les muscles dans leurs positions anatomiques.Ensuite, utilisez des sutures en soie 6-0 pour fermer le site de l'incision avec une à trois points séparés simples et placez la souris sur un tapis chauffant dans une cage propre en la surveillant jusqu'à ce qu'elle soit complètement rétablie. La compression du nerf pendant cinq secondes à l'aide d'une pince fine entraîne la disparition de la YFP du site de la lésion. L'épinévrone reste contigu, servant de conduit pour la régénération précise des axones vers leurs cibles d'origine.Chez des souris femelles âgées de 70 jours, la lésion nerveuse suffit à provoquer la dégénérescence de tous les segments axonaux situés en aval du soma neuronal, quatre jours après la compression. Sept jours après la compression, les terminaisons nerveuses réoccupent activement les sites post-synaptiques laissés vacants. Au douzième jour, les terminaisons nerveuses poursuivent leur différenciation en sites pré-synaptiques et les jonctions neuromusculaires sont entièrement réinnervées.Il existe peu de variabilité entre les souris dénervées pendant une durée identique, ce qui démontre que l'écrasement du nerf fibulaire peut être utilisé comme un test permettant de comparer la réinnervation musculaire entre des animaux de même âge et du même sexe. Comme prévu, plusieurs modifications surviennent dans les axones des motoneurones alpha lorsqu'ils réinnervent les fibres musculaires. Les cônes de croissance axonaux s'étendent et se ramifient en entrant en contact avec les sites post-synaptiques, s'étendant sur des régions spécifiques de la post-synapse, et aboutissant à une juxtaposition quasi complète des terminaisons axonales avec les sites post-synaptiques.Comme le montre la PCR quantitative, les gènes associés à la jonction neuromusculaire augmentent après la dénervation et diminuent lorsque les jonctions neuromusculaires sont réinnervées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre son temps, de visualiser toutes les structures et de vérifier soigneusement qu’un écrasement complet a été obtenu.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la PCR quantitative peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les gènes qui sont surexprimés ou sous-exprimés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer les régénérations synaptiques chez la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une compression du nerf fibulaire afin d'examiner les taux de réinnervation des jonctions neuromusculaires chez la souris.

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