Utilisation d'une batterie de produits chimiques et écotoxicologiques Méthodes pour l'évaluation de l'efficacité des processus de traitement des eaux usées pour supprimer œstrogénique Potency

L'objectif général de la batterie de tests décrite ici, comprenant la chimie analytique ainsi que des méthodes in vitro et in vivo, est de déterminer l'efficacité des technologies émergentes et nouvelles de traitement des eaux usées pour éliminer les contaminants œstrogéniques. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en génie environnemental, par exemple lors du choix des procédés de traitement des eaux usées les plus efficaces face à une activité œstrogénique variable des eaux usées. Le principal avantage de ces techniques réside dans leur sensibilité à de très faibles concentrations de composés actifs, permettant ainsi d'identifier les meilleures technologies pour protéger la vie aquatique.

Les procédures seront démontrées par le chercheur postdoctoral, Dr Chris Green, l'étudiante diplômée, Angela Pinzon, la chercheuse associée, Dr Alice Baynes, et la technicienne principale de recherche, Nicola Beresford. Le processus SPE exige une attention rigoureuse à la propreté et à l'ordre afin d'éviter la contamination des échantillons. Nettoyez préalablement tous les tubes, robinets et frittés avec du méthanol.

Avant de traiter les échantillons, fixez les lignes de transfert au collecteur d'extraction et rincez l'ensemble du système avec de l'eau déionisée. Pour traiter les échantillons, insérez d'abord les douilles jetables pour valve, puis fixez les cartouches SPE en styrène-divinylbenzène. Ensuite, pipetez cinq millilitres d'acétate d'éthyle dans chaque réservoir pour conditionner les cartouches.

Pendant cette étape, veillez à ce que l'EXC soit hermétiquement scellée. Ensuite, mettez en marche la pompe à vide pour un débit de 10 millimètres par minute. Avant que les cartouches ne s'assèchent, ajoutez cinq millilitres de méthanol, suivis de cinq millilitres d'eau.

Il est très important que les cartouches SPE ne s'assèchent pas. Une fois que l'eau a presque entièrement traversé, arrêtez la pompe et complétez chaque réservoir de cartouche avec de l'eau. Ensuite, reliez des tubes en PTFE de 1/8 de pouce entre les réservoirs des cartouches et les flacons en verre pour échantillons.

Maintenant, réglez le vide sur un débit inférieur à 10 millilitres par minute et laissez passer tout l'échantillon à travers la cartouche. Ensuite, séchez complètement les cartouches SPE jusqu'à ce que la couleur du contenu de la cartouche change. Utilisez un vide ou un courant de gaz.

Maintenant, chargez des vials de collecte en verre propres et secs de 10 millilitres dans un porte-échantillons et placez le porte-échantillons à l'intérieur du bloc d'extraction. Vérifiez que chaque insert se trouve bien au-dessus d'un vial. Remplissez les réservoirs d'échantillons avec deux fois quatre millilitres, soit un total de huit millilitres de dichlorométhane, mettez en marche la pompe à vide et laissez le liquide traverser la SPE et s'écouler dans les vials de collecte.

Ensuite, utilisez un concentrateur pour réduire le volume de tous les flacons de collecte à un millilitre. Transférez chaque échantillon dans un flacon d'auto-échantillonneur et concentrez-les davantage jusqu'à 100 microlitres à l'aide d'un équipement de concentration par soufflage à l'azote. La prochaine étape du processus consiste à utiliser la chromatographie par perméation de gel (GPC) pour éliminer les interférences macromoléculaires.

Commencez par injecter 95 microlitres de l'extrait d'échantillon éludé dans la CPG équipée d'une HPLC. Concentrez l'extrait de CPG jusqu'à 200 microlitres à l'aide d'un concentrateur et d'un appareil de concentration par courant d'azote, puis complétez jusqu'à deux millilitres avec de l'hexane. Ensuite, fixez des douilles de valve jetables, des cartouches amino purple et des réservoirs de cartouche sur le bloc de SPE, ainsi que les vials de collecte en verre de 10 millilitres.

Maintenant, chargez deux millilitres d'hexane dans chaque cartouche pour les conditionner, puis jetez le solvant. Ensuite, chargez l'extrait d'échantillon GPC dans le réservoir et aspirez-le à travers. Mettez l'extrait recueilli de côté et remplacez le flacon dans le porte-échantillons pour recueillir le lavage.

Ensuite, faites passer deux millilitres d’un mélange d’acétate d’éthyle et d’hexane à 30 pour cent en volume à travers la cartouche. Puis, ajoutez deux millilitres supplémentaires d’acétate d’éthyle et d’hexane, jetez les fractions de lavage recueillies et remettez le flacon de collecte de 10 millilitres dans le support. Ajoutez maintenant deux millilitres d’un mélange d’acétate d’éthyle et d’acétone à 50 pour cent en volume dans le réservoir, puis démarrez la pompe à faible débit, inférieur à deux millilitres par minute.

Une fois que le liquide est passé, ajoutez deux autres millilitres d'acétate d'éthyle à 50 % dans le réservoir. Utilisez ensuite un concentrateur pour réduire le volume de l'extrait à un millilitre. Transférez ensuite l'échantillon dans un petit flacon en verre et utilisez un appareil de concentration à l'azote pour évaporer l'extrait jusqu'à incipience. Ajoutez 100 microlitres de méthanol, mélangez soigneusement l'échantillon, puis transférez-le dans un flacon d'autoéchantillonneur muni d'un insert de 0,3 millilitre.

Ensuite, effectuez une analyse LC-MS/MS de l'extrait. La veille du début du test, préparez un milieu de croissance frais et ensemencez-le avec le témoin de culture HER de la souche utilisée. Le jour suivant, préparez le test en réalisant des dilutions sérielles de 100 microlitres des produits chimiques à tester ou des extraits d'effluents, puis une courbe étalon d'E2 dans l'éthanol.

Transférez maintenant des aliquotes de 10 microlitres dans une plaque stérile de 96 puits étiquetée. Laissez ensuite la plaque découverte afin d'évaporer l'éthanol. Préparez ensuite 50 millilitres de milieu de croissance contenant 0,5 millilitre de solution CPRG.

À partir de la culture de levures de 24 heures, mesurez la turbidité à 620 nanomètres pour estimer la densité cellulaire. Ensuite, ajoutez 40 millions de cellules de levures aux 50 millilitres de milieu d'essai. Transférez le milieu d'essai inoculé dans un bac stérile, puis utilisez une pipette multicanal pour transférer 200 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque d'essai.

Remplacez le couvercle de la plaque d'essai, scellez les bords avec du ruban adhésif et agitez vigoureusement la plaque pendant deux minutes à l’aide d’un agitateur pour plaque. Incubez ensuite la plaque à 32 °C dans une enceinte chauffante à ventilation naturelle. Après trois jours d’incubation, répétez l’agitation, puis laissez les levures se déposer pendant environ une heure.

Enfin, mesurez l'absorbance lumineuse des échantillons à 540 et 620 nanomètres. Des échantillons d'eau provenant d'une station d'épuration conventionnelle utilisant le procédé de boues activées ont été analysés par spectrométrie de masse en mode électrospray en ions négatifs (LCMS), et l'éthinylœstradiol était présent à une concentration supérieure au niveau prédit sans effet. Grâce à un traitement avancé de l'eau, tel que le charbon actif granulé, ou GAC, il a été possible de réduire substantiellement les concentrations d'éthinylœstradiol.

Toutes les extraits d'eaux usées ont été analysés à l'aide d'un étalon interne marqué par des isotopes, pic rouge, afin de permettre la quantification. Le test de dépistage levure-œstrogène s'est révélé clairement sensible à l'estradiol standard, mais n'a montré aucune réponse à l'éthanol, qui correspond essentiellement au témoin. Les cellules du test de dépistage à base de levure ont clairement réagi à l'effluent du procédé de boues activées, tandis que l'effluent traité au charbon actif granulaire a produit une réponse atténuée, bien qu'il reste plus actif biologiquement que le témoin.

Grâce à cette nouvelle technologie de traitement des eaux usées, la concentration en éthinylestradiol, indiquée en bleu, et l'activité œstrogénique, indiquée en vert, ont été significativement réduites par un traitement combiné au peroxyde d'hydrogène et au TAML. Les stations d'épuration des eaux usées constituent la principale source de contamination des eaux de surface par des substances œstrogéniques. De nouvelles approches visant à améliorer les procédés de traitement de l'eau nécessitent des tests approfondis de l'activité œstrogénique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d'une batterie de tests chimiques et d'écotoxicologie nécessaires pour mesurer l'activité œstrogénique dans des échantillons d'eau. Il est extrêmement important de s'assurer que la contamination des échantillons et des extraits est minimisée grâce à une manipulation soigneuse de ces derniers. Par exemple, les plastiques couramment utilisés contiennent des composés œstrogéniques ; il est donc essentiel d'inclure des contrôles négatifs afin de vérifier la contamination chimique, ainsi que des contrôles positifs pour s'assurer que la méthode d'extraction a fonctionné et qu'il y a une bonne récupération des œstrogènes ajoutés.