Utilisation d'une batterie de produits chimiques et écotoxicologiques Méthodes pour l'évaluation de l'efficacité des processus de traitement des eaux usées pour supprimer œstrogénique Potency

L’objectif global de la batterie d’essais décrite ici, y compris la chimie analytique et les méthodes in vitro et in vivo, est de déterminer l’efficacité des technologies émergentes et nouvelles de traitement des eaux usées pour éliminer les contaminants œstrogéniques. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en génie de l’environnement, par exemple, lors de la sélection des procédés de traitement des eaux usées les plus efficaces dans un pouvoir œstrogénique mobile des eaux usées. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont sensibles à de très faibles concentrations de composés actifs, mettant ainsi en évidence les meilleures technologies pour protéger la vie aquatique.

Le boursier postdoctoral, le Dr Chris Green, l’étudiante diplômée, Angela Pinzon, la chercheuse, la Dre Alice Baynes, et la technicienne de recherche principale, Nicola Beresford, feront la démonstration des procédures. Le processus SPE nécessite une attention particulière à la propreté et à l’ordre pour éviter la contamination des échantillons. Pré-nettoyez tous les tubes, robinets et frittes avec du méthanol.

Avant de prélever des échantillons, fixez les conduites de transfert au collecteur d’extraction et rincez l’ensemble du système avec de l’eau désionisée. Pour analyser les échantillons, fixez d’abord les doublures de valve jetables, puis fixez les cartouches SPE en styrène divinylbenzène. Ensuite, pipetez cinq millilitres d’acétate d’éthyle dans chaque réservoir pour conditionner les cartouches.

Au cours de cette étape, assurez-vous que le SPE est scellé. Ensuite, allumez la pompe à vide pour un débit de 10 millimètres par minute. Avant que les cartouches ne sèchent, chargez cinq millilitres de méthanol, suivis de cinq millilitres d’eau.

Il est très important que les cartouches SPE ne se dessèchent pas. Une fois que l’eau s’est écoulée, éteignez la pompe et remplissez chaque réservoir de cartouche avec de l’eau. Ensuite, connectez des tubes en PTFE de 1/8e de pouce entre les réservoirs de cartouche et les bouteilles d’échantillon en verre.

Maintenant, passez le vide à un débit inférieur à 10 millilitres par minute et laissez l’échantillon entier passer à travers la cartouche. Ensuite, séchez soigneusement les cartouches SPE, jusqu’à ce que le contenu de la cartouche change de couleur. Utilisez un aspirateur ou un flux de gaz.

Maintenant, chargez des flacons de collecte en verre de 10 millilitres propres et secs dans un rack et placez le rack à l’intérieur du collecteur d’extraction. Vérifiez que chaque manchon se trouve au-dessus d’un flacon. Chargez les réservoirs d’échantillons avec deux fois quatre millilitres, pour un total de huit millilitres de dichlorométhane, allumez la pompe à vide et laissez passer le liquide à travers le SPE et dans les flacons de collecte.

Ensuite, utilisez un concentrateur pour réduire le volume de tous les flacons de collecte à un millilitre. Transférez chaque échantillon dans un flacon d’échantillonneur automatique et concentrez-les davantage jusqu’à 100 microlitres, à l’aide d’un équipement de purge d’azote. La prochaine étape du processus consiste à utiliser la GPC pour éliminer les interférences macromoléculaires.

Tout d’abord, injectez 95 microlitres de l’extrait d’échantillon éludé dans le HPLC équipé d’un GPC. Concentrez l’extrait GPC à 200 microlitres, à l’aide d’un concentrateur, et de l’appareil de purge d’azote, puis remplissez-le jusqu’à deux millilitres d’hexane. Ensuite, fixez les doublures de valve jetables, les cartouches amino purple et les réservoirs de cartouche au collecteur SPE et à travers les flacons de collecte en verre de 10 millilitres.

Maintenant, chargez deux millilitres d’hexane dans chaque cartouche, pour les conditionner et jeter le solvant. Ensuite, chargez l’extrait de l’échantillon GPC dans le réservoir et aspirez-le. Mettez de côté la collection d’extraits et replacez le flacon dans le support pour récupérer le lavage.

Ensuite, passez deux millilitres de 30 % d’acétate d’éthyle et d’hexane volume par volume à travers la cartouche. Ensuite, ajoutez deux millilitres supplémentaires d’acétate d’éthyle et d’hexane, puis jetez les collections de solution de lavage et remettez le flacon de collecte de 10 millilitres dans le panier. Maintenant, ajoutez deux millilitres d’acétate d’éthyle et d’acétone à 50 % volume par volume dans le réservoir et démarrez la pompe à un faible débit, inférieur à deux millilitres par minute.

Une fois que le liquide a pénétré, ajoutez deux millilitres supplémentaires d’acétate d’éthyle à 50 % dans le réservoir. Maintenant, utilisez un concentrateur pour réduire le volume d’extrait à un millilitre. Ensuite, transférez l’échantillon dans un flacon en verre plus petit et utilisez un équipement de purge d’azote pour évaporer l’extrait jusqu’à ce qu’il devienne un débutant. Ajoutez 100 microlitres de méthanol, mélangez bien l’échantillon et transférez-le dans un flacon d’échantillonneur automatique avec un insert de 0,3 millilitre.

Ensuite, effectuez une analyse LC-MS/MS de l’extrait. La veille du début de l’essai, préparez un milieu de croissance frais et inoculez-le avec le tenax dock de la souche HER utilisée. Le lendemain, préparez-vous pour le test, en faisant des délires en série de 100 microlitres des produits chimiques d’essai ou des extraits d’effluents, puis une courbe standard E2 dans l’éthanol.

Maintenant, transférez des aliquotes de 10 microlitres dans une plaque stérile à 96 puits étiquetée. Ensuite, laissez la plaque à découvert pour évaporer l’éthanol. Ensuite, préparez 50 millilitres de milieu de croissance, avec 0,5 millilitre de solution CPRG.

À partir de la culture de levure de 24 heures, mesurez la turbidité à 620 nanomètres pour estimer la densité cellulaire. Ensuite, ajoutez 40 millions de cellules de levure aux 50 millilitres de milieu de dosage. Transférez le milieu de test inoculé dans une auge stérile et utilisez une pipette multicanaux pour transférer 200 microlitres de milieu dans chaque puits de la plaque de test.

Replacez le couvercle de la plaque de test, scellez les bords avec du ruban adhésif et secouez vigoureusement la plaque de test pendant deux minutes à l’aide d’un agitateur de plaques. Ensuite, incubez la plaque à 32 degrés Celsius, dans une armoire chauffante à ventilation naturelle. Après trois jours d’incubation, répétez l’agitation à nouveau, puis laissez la levure se déposer pendant environ une heure.

Enfin, mesurez les absorbants de lumière par les échantillons, à 540 et 620 nanomètres. Des échantillons d’eau provenant d’un plan de traitement des eaux usées conventionnel pour activer son processus de traitement des boues ont été analysés à l’aide d’un système d’électronébulisation d’ions négatifs LCMS, l’éthinylestradiol était présent à une concentration supérieure au niveau sans effet prévu. En utilisant un traitement avancé de l’eau, tel que le charbon actif granulé, ou CAG, il a été possible de réduire considérablement les niveaux d’éthinylestradiol.

Tous les extraits d’eaux usées ont été analysés à l’aide d’un étalon interne isotopique, le pic rouge, afin de permettre la quantification. Le test de dépistage de la levure à l’œstrogène était clairement sensible à l’œstradiol standard, mais n’a choisi aucune réponse à l’éthanol, qui est essentiellement le blanc. Les cellules de tamisage de levure étaient clairement sensibles à l’effluent du procédé de boues activées, tandis que l’effluent traité au CAG produisait une réponse diminuée, il était toujours plus biologiquement actif que le blanc.

Grâce à cette nouvelle technologie de traitement des eaux usées, la concentration d’éthanol-œstradiol, représentée en bleu, et l’activité œstrogénique, indiquée en vert, ont été considérablement réduites par le traitement combiné au peroxyde d’hydrogène et au TAML. Les stations d’épuration des eaux usées sont la principale source de contamination des eaux de surface par des substances œstrogéniques. De nouvelles méthodes pour améliorer ces effluents nécessitent des tests approfondis de l’activité œstrogénique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d’une batterie de tests chimiques et écotoxicologiques, nécessaires pour mesurer l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Il est extrêmement important de s’assurer que la contamination des échantillons et des extraits est minimisée grâce à une manipulation soigneuse des échantillons et des extraits. Par exemple, les plastiques couramment utilisés contiennent des composés œstrogéniques, il est donc essentiel d’inclure des contrôles négatifs pour vérifier la contamination chimique, et des contrôles positifs pour vérifier que la méthode d’extraction a fonctionné et qu’il y a une bonne récupération des œstrogènes enrichis.