Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules

Ce rapport décrit des protocoles pour mesurer les taux de dégradation des protéines mal repliées par transfert Western ou par des tests basés sur la fluorescence. Les méthodes peuvent être appliquées à l’analyse d’autres protéines mal repliées et au criblage à haut débit.

L’objectif global de ce test est de mesurer les taux de dégradation cellulaire des protéines mal repliées. Les protéines mal repliées sont associées à de nombreuses maladies neurodégénératives. Ce test permet d’étudier les systèmes de contrôle de la qualité des protéines cellulaires qui sont des protecteurs contre les protéines aberrantes.

Les protéines sujettes au mauvais repliement peuvent exister sous différentes formes dans les cellules. En combinant le fractionnement cellulaire avec la méthode de chasse au cyclohexane, le principal avantage de cette technique est de mesurer spécifiquement la demi-vie de l’espèce mal repliée. Nous utilisons deux protéines modèles à titre d’exemple.

Une protéine polyglutamate hautement sujette à l’agrégation, Atxn1 82Q et un mutant luciférase nucléaire instable sur le plan conformationnel. Le protocole peut également être appliqué à d’autres mesures de protéines mal repliées. Pour effectuer un test de dégradation de l’Atxn1 82Q GFP, plaquez environ 3x10^5 cellules HeLa sur des plaques de 35 millimètres avec un milieu DMEM et 10 %FBS.

Incuber les cellules pendant la nuit afin qu’elles atteignent 40 à 60 % de confluence au moment de la transfection. Quatre à cinq heures après la transfection des cellules avec Atxn1 82Q GFP PRK5, sous un microscope à fluorescence, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 450 à 490 nanomètres pour examiner les cellules vivantes à la recherche d’une expression de la GFP dans les noyaux, caractérisée par la présence de signaux GFP diffus et de petits chatoiements. Juste avant le traitement au cycloheximide, récoltez une plaque de cellules en retirant le milieu et en utilisant trois millilitres de PBS glacé pour laver les cellules deux fois.

Ensuite, congelez l’assiette sur de la glace sèche. Pour les plaques de cellules restantes, prélever le milieu par aspiration intra-ude et ajouter deux millilitres de DMEM frais contenant 50 microgrammes par millilitre de cycloheximide. Ajoutez également 10 micromolaires de l’inhibiteur du protéasome, MG132, dans une assiette.

Incuber les cellules traitées pendant quatre, huit, 12 et 16 heures avant de les congeler sur de la glace sèche. Après avoir récolté les cellules traitées au MG132 après 16 heures, grattez les cellules congelées de toutes les plaques dans 150 microlitres de tampon de lyse cellulaire froide et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Centrifugez les lysats dans une centrifugeuse de paillasse à 17 000 x g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Transférez ensuite le surnageant qui contient des protéines solubles MP40 dans un autre tube. Rincez les granulés en ajoutant doucement environ 200 microlitres de 1x PBS dans les tubes sans déranger les granulés. Retirez délicatement le PBS par aspiration ou pipette, remettez les granulés en suspension dans 150 microlitres de tampon à granulés glacés, puis incubez-les sur de la glace pendant 15 à 30 minutes.

Ajoutez ensuite 75 microlitres de tampon d’ébullition 3x dans les fractions solubles MP40 et les fractions insolubles MP40 remises en suspension des granulés. Ensuite, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius sur un bloc chauffant pendant cinq minutes. Ajouter le tampon de chargement de gel SDS à une aliquote de fractions liposolubles et insolubles MP40 bouillies.

Chargez des volumes égaux d’échantillons collectés à tous les points temporels sur un gel SDS-PAGE. Détectez la GFP soluble dans MP40 et l’Atxn1 82Q soluble dans le SDS par Western blot à l’aide d’un anticorps anti-GFP et d’une chimiluminescence améliorée. Pour examiner la résistance au SDS Atxn1 82Q de la fraction granulée à l’aide d’un test de retard de filtre, installez un appareil à diagrammes de points tenant une membrane d’acétate de cellulose de 0,2 micron

Chargez ensuite 80 à 120 microlitres d’échantillons insolubles de MP40 bouillis dans chaque puits de l’appareil à transfert de points. Après avoir filtré les échantillons à travers la membrane par vide, détectez les agrégats GFP Atxn1 82Q collés sur la membrane par immunobuvardage anti-GFP. Il est essentiel d’utiliser un test de retard de filtre pour examiner les niveaux de forme résistante aux SDS au fil du temps.

En effet, la forme soluble dans le SDS peut se transformer en une forme résistante au SDS plutôt que d’être dégradée. Dans cet exemple, la forme résistante aux SDS est minimale et reste à un niveau similaire par rapport à l’expérience de poursuite. Pour effectuer un test de dégradation, après une transfection nocturne de cellules HeLa avec NLS-luciférase-GFP, examinez les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversée pour l’expression de la GFP avec une longueur d’onde d’excitation de 450 à 490 nanomètres.

Juste avant le traitement au cycloheximide, récoltez une plaque de cellules en retirant le milieu et utilisez trois millilitres de PBS glacé pour laver les cellules deux fois. Ensuite, congelez l’assiette sur de la glace sèche. Pour les plaques restantes, après avoir retiré le milieu, ajoutez deux millilitres de DMEM frais contenant 50 microgrammes par millilitre de cycloheximide et ajoutez 10 micromolaires de l’inhibiteur de protéasome MG132 dans une plaque.

Traitez les cellules pendant 1,5, trois, 4,5 et six heures avant de récolter comme décrit ci-dessus, en récoltant les cellules traitées au MG132 pendant six heures. Après avoir récolté le dernier point temporel des cellules, grattez chaque plaque dans 150 microlitres de tampon de lyse cellulaire froide et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Incuber les échantillons sur un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, avant d’effectuer SDS-PAGE et Western blot selon le protocole de texte.

Ajouter un tampon de chargement de gel SDS à des lysats de cellules entières pour une concentration finale de 2 % de SDS et de 50 millimolaires de DTT. Après l’ensemencement et la transfection des cellules HeLa dans des plaques à 96 puits selon le protocole de texte, 20 à 24 heures après la transfection, examinez les cellules pour l’expression de la GFP. Retirez le fluide, ajoutez environ 200 microlitres de 1x PBS dans chaque puits, puis aspirez-le pour éliminer le DMEM résiduel.

Ajoutez 60 microlitres de DMEM à faible fluorescence avec 5 % FBS et 50 microgrammes par millilitre de cycloheximide et ajoutez 10 micromolaires MG132 à un ensemble d’échantillons. Avec un lecteur de plaques à fluorescence, mesurez le signal GFP, en lisant les plaques toutes les heures pendant une période allant jusqu’à huit à dix heures. Exportez les données et effectuez des analyses statistiques selon le protocole texte.

Dans une analyse à l’état stationnaire, des agrégats nucléaires GFP Atxn1 82Q microscopiquement visibles peuvent être observés dans 30 à 50 % des cellules HeLa 20 heures après la transfection. Comme le montre le transfert Western, la demi-vie de la GFP Atxn1 82Q dans la fraction soluble SDS est d’environ cinq heures. En revanche, une diminution légère ou nulle de la GFP Atxn1 82Q dans la fraction soluble MP40 sur 16 heures.

La dégradation de la GFP Atxn1 82Q est partiellement inhibée par le traitement des cellules avec MG132. Ces images illustrent que 20 heures après la transfection, les agrégats GFP mutants de la NLS-luciférase DM deviennent visibles au microscope dans cinq à 15 % des cellules HeLa. Les Western blots ont révélé que la demi-vie de la GFP mutante de la NLS-luciférase DM soluble dans la SDS est de deux à trois heures.

De plus, l’intensité de la fluorescence des cellules transfectées diminue également avec le temps lors du traitement au cycloheximide. Environ six heures après le traitement au cycloheximide, la GFP soluble de la NLS-luciférase DM est largement dégradée, ce qui suggère que la fluorescence restante est générée à partir d’espèces agrégées résistantes à la dégradation. Ces images de fluorescence confirment que la GFP agrégée, mais non diffuse, reste dans les cellules neuf heures après le traitement au cycloheximide.

Eh bien, le test basé sur l’immunblot prend quelques jours à accomplir. Les taux de dégradation des protéines peuvent être obtenus immédiatement après la poursuite du cycloheximide à l’aide d’un test basé sur la fluorescence. Les tests basés sur l’immunobuvardage et la fluorescence peuvent être appliqués à des études sur d’autres protéines mal repliées.

Ce dernier est également adapté au criblage à haut débit pour identifier des macromolécules ou de petits composés capables de moduler la dégradation de protéines mal repliées. Il est important de se rappeler que pour certaines protéines mal repliées telles que Atxn1 82Q, la demi-vie ne peut être mesurée que par fractionnement cellulaire et immunoblottage, car les espèces mal repliées qui se dégradent rapidement ne représentent qu’une petite partie de l’expression globale d’Atxn1 82Q. Pour découvrir le mécanisme d’un contrôle de la qualité des protéines, les tests de dégradation des protéines doivent être couplés à l’analyse des niveaux d’état stationnaire des agrégats ainsi que du fait qu’ils sont des partitions dans différentes fractions cellulaires.

D’autres expériences, telles que des tests in vitro de repliement et d’agrégation des protéines, peuvent également être réalisées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les taux de dégradation des protéines mal repliées à l’aide de différentes stratégies. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.