L'étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

L’objectif global de ces expériences est de déterminer le rôle des macrophages alvéolaires pulmonaires dans les métastases cancéreuses à l’aide d’un modèle syngénique du cancer du sein. Cette méthode peut répondre à certaines des questions clés dans les domaines de l’immunologie tumorale et des métastases cancéreuses, telles que pourquoi les poumons sont l’une des cibles les plus courantes des métastases cancéreuses hémopathogènes. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise un modèle de cancer du sein très bien établi avec une méthode très spécifique des microphages alvéolaires pulmonaires.

La démonstration de cette procédure sera faite par Surya Kumari Vadrevu, associée de recherche dans mon laboratoire. Le jour de l’injection de cellules tumorales, placez d’abord une souris rasée et anesthésiée sur un tampon chirurgical. Ensuite, aspirez une fois 10 à la cinquième cellules tumorales dans 100 microlitres de PBS dans une seringue à insuline de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 29.

Ensuite, utilisez le pouce et l’index pour soulever la peau près des deuxième et troisième mamelons, et insérez l’aiguille sous la peau dans le coussinet adipeux mammaire juste en dessous du troisième mamelon. Injectez lentement les cellules par voie sous-cutanée pour former une bulle sous la peau et retournez l’animal dans sa cage sous surveillance jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Quatre à cinq jours après l’inoculation, pour mesurer les tumeurs, palpager le site de la tumeur et utiliser un pied à coulisse pour utiliser à la fois le plus grand et le plus petit diamètre des tumeurs pour déterminer le volume tumoral.

Pour imager les cellules 41GFP injectées, placez la souris anesthésiée sur une platine mobile à l’intérieur de l’imageur et imagez le site de la tumeur par microscopie à fluorescence. Dans une armoire de biosécurité à flux d’air de lamineuse, six jours après l’injection de cellules tumorales, vortex les liposomes pour répartir uniformément les particules et aspirer 60 microlitres de suspension dans une pointe de pipette stérile. Placez l’embout près de la narine de l’animal anesthésié inoculé contre la tumeur et libérez lentement cinq microlitres de solution liposomale, permettant à la souris d’inhaler la goutte.

Il est essentiel d’administrer la solution liposomique lentement tout en maintenant le niveau d’anesthésie approprié pour permettre à l’animal de respirer régulièrement pendant l’accouchement. Lorsque les 60 microlitres ont été administrés, laissez la souris se rétablir complètement et retournez l’animal dans sa cage. Pour compter et noter les métastases à la surface des poumons, placez les poumons sous le microscope de dissection et concentrez l’objectif jusqu’à ce qu’une vue claire de la surface des poumons ait été obtenue.

Ensuite, comptez manuellement les métasses sur les côtés antérieur et postérieur des deux poumons, et imagez les tumeurs par microscopie à fluorescence. Après avoir compté et imagé les métastases, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces pour hacher le poumon et transférez les morceaux de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant trois millilitres de tampon de digestion. Testez les fragments sur un agitateur rotatif dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes, puis tritérez la boue pour dissocier le tissu.

Ensuite, filtrez la suspension de tissu à travers une passoire de 40 microns pour éliminer les grumeaux, en pressant les plus gros morceaux à travers la passoire avec un piston de seringue si nécessaire. Lorsqu’une suspension unicellulaire a été obtenue, prélever les cellules par centrifugation et lyser les globules rouges avec un tampon ACK pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez le granulé deux fois dans huit millilitres de RPMI.

Après la deuxième centrifugation, nous suspendons les cellules dans trois millilitres de milieu RPMI complet pour le comptage, et nous faisons tourner à nouveau les cellules. Maintenant, diluez les cellules à une fois 10 à la sixième cellules par 100 microlitres de concentration de tampon FAX, et transférez des éloquotes de 100 microlitres de cellules dans des puits individuels d’une plaque à fond en V de 96 puits. Récupérez les cellules au fond des puits par centrifugation, puis retournez la plaque pour laisser le tampon s’écouler.

Bloquez les cellules avec 100 microlitres de CD16 CD32 FC pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, et centrifugez à nouveau la plaque. Ensuite, retournez la plaque pour retirer le surnageant, comme nous venons de le démontrer, et ajoutez le cocktail d’anticorps d’intérêt dans les puits appropriés. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, granulez les cellules par centrifugation, suivie d’un lavage avec 200 microlitres de tampon FAX.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS frais et colorez les échantillons avec un colorant de viabilité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans 200 microlitres supplémentaires de PBS et fixez les échantillons dans 100 microlitres de 1 % de paraformaldéhyde pour les stocker à quatre degrés Celsius. Immédiatement avant leur analyse, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de cytométrie en flux de polypropylène.

L’injection de cellules tumorales 4T1GFP dans le coussinet adipeux mammaire conduit à la formation de tumeurs de souris qui récapitulent la propagation métastatique du cancer du sein humain, comme en témoignent les métastases à formation rapide observées dans les poumons. La transfection stable des cellules 4T1 avec la GFP facilite le suivi des cellules tumorales métastasantes et la quantification de la charge métastatique. L’hastologie de routine, associée aux algorithmes de pathologie numérique, constitue également un bon outil pour quantifier et vérifier les métastases.

De plus, l’analyse cycométrique en flux multicolore permet de caractériser même des populations cellulaires rares, telles que les macrophages alvéolaires CD11b négatifs, CD11c F80 positifs. L’appauvrissement du biclotrénate peut être confirmé par l’absence de ces cellules CD11c F480 positives dans les poumons dissociés d’animaux traités au lyposome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter des cellules tumorales dans le coussinet adipeux mammaire, de surveiller la croissance tumorale et les métastases, d’appauvrir les macrophages alvéolaires et de préparer les cellules pulmonaires pour l’analyse cycométrique en flux.