Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme

essais de chimiotaxie visuels sont essentiels pour une meilleure compréhension de la façon dont les cellules eucaryotes contrôler la migration cellulaire chimiotactique directionnelle médiée. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour: 1) en temps réel, la surveillance à haute résolution de plusieurs essais de chimiotaxie, et 2) visualisant simultanément le gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les cellules HL60 neutrophiles comme la signalisation.

L’objectif global de ce modèle est de permettre la surveillance simultanée de plusieurs tests de chimiotaxie, ou la visualisation des multiples événements de signalisation d’une seule cellule de chimiotaxe. Les biologistes cellulaires d’Overdeck ont développé plusieurs approches différentes pour quantifier le comportement chimiotaxique des cellules. Jusqu’à récemment, nous étions en mesure de répondre à des questions clés dans le domaine de la chimiotaxie, telles que la surveillance simultanée de plusieurs tests de chimiotaxie.

Le principal avantage de cette technologie est d’appliquer le principe de la microfluidique pour générer des ingrédients hautement reproductibles et fiables pour plusieurs tests de chimiotaxie simultanés avec une haute résolution en temps réel. La démonstration de la procédure sera assurée par le Dr Xi Wen, post-doctorant de notre laboratoire. Pour assembler le support, utilisez d’abord les leviers pour positionner la base en position verticale afin que les leviers puissent s’incliner vers l’utilisateur.

Ensuite, enduisez brièvement la surface du verre de 41 millimètres avec de l’éthanol à 70 % et utilisez une lingette pour retirer soigneusement l’éthanol. Insérez le verre dans la base du support et placez une lamelle de recouvrement carrée de 2 millimètres recouverte de BSA sur le verre. Ensuite, insérez le petit joint torique dans le bas du boîtier de la plaquette et montez le boîtier de la plaquette dans la base du support, avec le trou elliptique à l’arrière de l’instrument.

Tirez le niveau intérieur de la base du support vers l’avant en position horizontale, pour verrouiller le boîtier de la plaquette en place. À l’aide d’un dépoussiéreur, soufflez les débris de l’intérieur du boîtier de la plaquette. Ajoutez ensuite 4 millilitres de RPMI 1640 medium, complété par 0,1 % BSA, dans le boîtier.

Montez maintenant la puce du dispositif d’analyse de mobilité cellulaire revêtue de BSA au centre du boîtier de la plaquette avec la face structurelle en contact avec le verre et avec le repère de positionnement à l’arrière. Insérez les deux saillies du joint en caoutchouc dans les trous pour fixer le joint au bas de la pince de la plaquette et montez le grand joint torique sur le dessus du boîtier de la plaquette. Montez ensuite la pince à plaquettes avec le trou du capteur à l’arrière et tirez le levier extérieur de la base du boîtier vers l’avant en position horizontale pour verrouiller la pince à plaquettes en place.

Une fois le support assemblé, placez le bas du support sur une boîte à lumière pour confirmer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les puits. Retirez ensuite le couvercle, transférez l’ensemble sur la plaque située au-dessus de l’appareil d’analyse de la mobilité cellulaire et fixez le bloc de capteur au support. Pour effectuer le test de mobilité cellulaire, nous mettons d’abord en suspension des cellules HL60 différenciées dans un milieu RPMI 1640 complété par BSA, et une concentration de deux fois dix à six cellules par millilitre.

Ensuite, connectez l’unité de l’appareil d’analyse de la mobilité cellulaire à l’ordinateur pour l’acquisition d’images, puis allumez les deux appareils. Ensuite, ouvrez le logiciel de l’appareil d’analyse de la mobilité cellulaire. Dans le panneau de configuration de l’image de l’appareil photo, utilisez les lignes horizontales et verticales pour ajuster la position du support en temps réel et centrez l’appareil dans le panneau d’image de l’appareil photo.

Sélectionnez ensuite le canal un pour déplacer la caméra vers le canal sélectionné, puis utilisez Déplacer vers la gauche ou Déplacer vers la droite pour ajuster la coordonnée X de la caméra afin de centrer le champ de vue horizontalement. Pour ajuster verticalement l’image au centre de l’écran, tournez le bouton de position situé sur le panneau avant de l’appareil d’analyse de mobilité cellulaire. Sur le panneau de commande de l’appareil de chauffage, réglez la température du support sur 37 degrés Celsius et la température de la plaque sur 39 degrés Celsius.

Pour contrôler la température à l’aide du capteur thermique connecté au support, cliquez sur Chauffer pour démarrer le chauffage, puis sur Support. Sur le panneau de prise de vue, entrez 15 secondes pour l’intervalle et 30 minutes pour le temps afin de définir les intervalles et la durée du test de chimiotaxie, respectivement. Pour des raisons de sécurité, sélectionnez l’arrêt du chauffage à la fin de la boîte de tir.

Ensuite, enregistrez le fichier, entrez les détails de l’expérience dans le panneau mémo et confirmez que l’appareil a été centré dans tous les canaux. Retirez maintenant tout le tampon du support et huit microlitres de tampon du troisième puits à partir du haut du premier canal. À l’aide d’une seringue, injectez deux microlitres de cellules dans le second puits du même canal, tout en surveillant l’écran en temps réel pour contrôler le nombre de cellules et le débit lors de l’injection.

Lorsque les cellules sont alignées, rajoutez immédiatement les huit microlitres de tampon dans le puits et répétez l’injection de cellules dans les canaux deux à six, comme nous venons de le démontrer. Une fois que toutes les cellules ont été ajoutées, ajoutez deux millilitres de tampon dans le support et ajoutez un microlitre de chimioattractif dans le troisième puits à partir du haut dans les canaux appropriés. Enfin, lancez l’acquisition de l’image.

Dans cette expérience représentative, les cellules HL60 commencent la chimiotaxage en ligne droite immédiatement après l’injection du chimioattractant, et se poursuivent pendant les 60 minutes du test, conformément aux résultats de la simulation de stabilité du gradient. Le traçage de la trajectoire et de la morphologie des cellules permet la mesure quantitative et la comparaison ultérieure des comportements de chimiotaxie, à l’aide d’un indice de chimiotaxie qui comprend la longueur totale du trajet, la directionnalité, la vitesse et la rondeur des cellules. L’application d’un colorant fluorescent, en conjonction avec le chimioattractant, permet d’établir une relation linéaire entre la concentration de chimioattractant et l’intensité du colorant fluorescent contrôlé.

De plus, en réponse à une stimulation chimioattractante appliquée uniformément, les cellules HL60 médient une translocation membranaire robuste de la protéine kinase GFP tact D1.In un gradient chimioattractant, les cellules HL60 recrutent activement la kinase à l’arrière du bord d’attaque. Une fois maîtrisé, ce processus peut être complété en 30 minutes s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de suivre strictement les instructions du fabricant sur l’assemblage du support et de surveiller l’injection de la cellule.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la chimiotaxie pour explorer la possibilité de plusieurs tests de chimiotaxie, tels qu’un monogénisme dictyostilium, ou d’autres types de systèmes cellulaires mammalliens. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler l’unité, d’effectuer des tests de chimiotaxie simultanés ou de visualiser simultanément plusieurs événements de signalisation dans les cellules de chimiotaxation.