Name: Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez la surveillance en temps réel de l'assay de chimiotactisme et la visualisation des événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles. Cette méthode microfluidique permet une observation haute résolution de la migration cellulaire.

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent pour ce travail.

Dans la présente étude, nous montrons deux exemples de dosages de chimiotaxie: tout d&#39;abord, la surveillance simultanée de plusieurs essais de chimiotaxie par le dispositif d&#39;analyse de la mobilité de la cellule; et, deuxièmement, la visualisation du gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les mêmes cellules en temps réel de signalisation. la mobilité cellulaire dispositif d&#39;analyse pour de multiples essais de chimiotaxie simultanés Dans la présente étude, nous avons introduit un protocole détaillé pour effectuer plusieurs essais de chimiotaxie simultanée en utilisant un dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire. Ce dispositif permet à l&#39;utilisateur d&#39;observer le comportement de la chimiotaxie cellulaire avec un objectif 10X dans l&#39;observation champ lumineux conventionnel. En raison des caractéristiques de diffusion dominante de l&#39;écoulement de fluide, le dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire génère des gradients très stables et prévisibles et permet jusqu&#39;à six chimiotaxie des essais à effectuer en même temps. Les étapes critiques du protocole sontpour obtenir des gradients fiables et d&#39;aligner les cellules sur la ligne de terrasse. L&#39;utilisateur doit suivre strictement les instructions du fabricant pour l&#39;ensemble de support et de l&#39;injection de chemoattractants et des cellules. Des instructions détaillées sont également disponibles en ligne. Par rapport aux méthodes alternatives de chimiotaxie 11-13,15, ce dispositif améliore considérablement la fiabilité et l&#39; efficacité des essais de chimiotaxie. Quatre tailles de puce de dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire dans des tailles de 4, 5, 6 et 8 um sont disponibles pour accueillir différents types et tailles de cellules. Nous avons constaté qu&#39;une mobilité cellulaire puce de dispositif d&#39;analyse 4 ou 5 um convient pour la HL60 et D. cellules discoideum, qui sont environ 10-15 um de diamètre. Cependant, une limitation est que ce dispositif ne convient pas à tous les types de cellules. Nous avons eu peu de succès en utilisant la mobilité cellulaire dispositif d&#39;analyse chimiotaxie test avec des cellules Raw267.4. La raison peut être que les cellules migrent Raw267.4 trop lentement. Le temps nécessaire pour l&#39;efficacité chemotaxis des cellules Raw267.4 pourrait être beaucoup plus longue que le temps d&#39;un gradient est maintenu par le dispositif. Au lieu de cela, un test de migration Transwell a bien fonctionné pour les cellules Raw267.4 9. Une autre limitation est que l&#39;observation fluorescente est pas possible avec le dispositif actuel. Une orientation future consiste à surveiller l&#39;imagerie de fluorescence avec un grossissement plus élevé. Ceci est possible avec le dispositif perfectionné d&#39;analyse de la mobilité cellulaire, qui est équipé d&#39;une détection fluorescente et un objectif 100X. En outre, le nombre de dosages simultanés est également augmenté à 12. Toutes ces améliorations facilitent le débit amélioré des essais de chimiotaxie et l&#39;observation de la dynamique sous-cellulaires dans des cellules en migration. Haute efficacité de transfection de cellules HL60 pour exprimer la protéine de protéine marqué fluorescent les cellules HL60 sont une lignée de cellules de leucémie divisant activement et se développent en suspension. Comme indiqué précédemment 18-20, les cellules HL60 sont résistantes à gtransfert ène. Les deux lipides et le transfert de gènes d&#39;électroporation ont été testés, et une plus grande efficacité de transfection a été obtenu avec l&#39;électroporation, comme décrit en détail dans la section 4. Obtenir une viabilité élevée après l&#39;électroporation est essentielle pour obtenir une grande efficacité de transfection en raison des dommages graves qui résulte de l&#39;électroporation. Par la suite, la manipulation minutieuse et douce cellule sont nécessaires, en particulier après l&#39;électroporation. Tous les médias doivent être préchauffée et doucement ajouté aux cellules dans toutes les étapes après l&#39;électroporation. Il est également important de réduire au minimum le temps d&#39;exposition des cellules au réactif électroporation. Afin d&#39;éviter la mort des cellules après l&#39;électroporation, le milieu RPMI 1640 de récupération de l&#39;électroporation doit être ajouté aux cellules immédiatement. Nous avons constaté que 20% de FBS dans le milieu de récupération donne un taux de récupération des cellules beaucoup plus élevée que 10% de FBS. Après l&#39;électroporation, l&#39;incubation dans du RPMI 1640 électroporation milieu de récupération pendant 30 min est essentielle pour une plus grande viabilité et transfectionEfficacité. Pour augmenter encore l&#39;efficacité de transfection, on a également utilisé 4 pg d&#39;ADN de plasmide par transfection, ce qui est presque le double de la quantité de plasmide recommandé par le fabricant. Il existe deux grandes limitations sur électroporation transfection: l&#39;transiency de l&#39;expression de la protéine et la limite du nombre de cellules (2 x 10 6 cellules par transfection). Dans les cellules non différenciées, l&#39;expression est détectable uniquement pendant les deux premières divisions cellulaires, étant donné que le plasmide vecteur est dilué par moitié après chaque division cellulaire. Pour La HL60 différenciées des cellules survivent pas plus de 48 heures. Par conséquent, toute expérience exige des transfections fraîches 6 heures avant l&#39;expérience. Le nombre de cellules pour une électroporation répond simplement à l&#39;exigence minimale pour tous les dosages biochimiques. Aux fins de l&#39;utilisation répétitive ou grande quantité, il est fortement recommandé qu&#39;une lignée de cellules HL60 indifférenciée établie qui exprime de manière stable la protéine d&#39;intérêt which a été marqué avec une protéine fluorescente par un vecteur viral, dans le cas d&#39;un vecteur viral est disponible ou peut être construite.

Les cellules eucaryotes sens et se déplacent vers la plus forte concentration dans un gradient chimiotactique, un processus cellulaire désigné comme chimiotaxie. Chimiotaxie joue un rôle critique dans de nombreux processus physiologiques, tels que l&#39; embryogenèse 1, neurone patterning 2, les métastases de cellules cancéreuses 3, le recrutement des neutrophiles vers les sites d&#39;inflammation 4, et le développement de l&#39;organisme modèle 5 Dictyostelium discoideum. En général, les cellules eucaryotes détectent chemoattractants en utilisant G récepteurs couplés à la protéine 5. L&#39;engagement des chemoattractants avec ces récepteurs favorise la dissociation des protéines G hétérotrimériques et Ga Gßy, qui activent à leur tour en aval des voies de transduction du signal qui régulent finalement l&#39;organisation spatio - temporelle du cytosquelette d&#39;actine pour entraîner la migration des cellules 5-9. Les biologistes cellulaires ont été perfectionnés en chemotaxest des tests pour examiner comment G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) de signalisation médie dirigés la migration cellulaire. La chambre ou la migration Transwell test Boyden a été développé en 1960 par Boyden 10. Le dosage fonctionne en créant un gradient de composés chimiotactiques entre deux puits qui sont séparés par une membrane microporeuse. Sa simplicité et sa facilité d&#39;utilisation en font chimiotaxie test le plus largement utilisé à ce jour. Cependant, l&#39;essai ne permet pas la migration du processus des cellules à visualiser. La chambre Zigmond est le premier dispositif microfluidique visuel qui permet l&#39; imagerie claire de la migration cellulaire sur une lamelle à travers un étranglement étroit vers un chimiotactique de source 11. Dunn 12 et Insall 13 modifiés et améliorés à haute résolution et de la capacité d&#39;imagerie à long terme de la chimiotaxie de chambre dosage Zigmond. En raison des caractéristiques hautement prévisibles, diffusion-dominante de l&#39;écoulement du fluide, la microfluidique a été la fourniture de solutions pour la prochaine generatisur des tests de chimiotaxie, tels que EZ-TAXIScan (un dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire). Avec la stabilité du gradient assurée, le dispositif permet chimiotaxie six essais à effectuer en même temps (figure 1A). Par contraste avec les gradients directionnellement fixes générés dans les différents essais de la chambre ci - dessus, le dosage de l&#39; aiguille ou micropipette développée par Guenther Gerisch génère un gradient avec une source mobile 14. Dans l&#39;essai, chimioattractant est libéré à partir d&#39;une micropipette mobile pour générer un gradient stable. Avec ce test de l&#39;aiguille, les chercheurs ont constaté que les cellules différentes génèrent pseudopodes avec des caractéristiques fondamentalement différentes. En appliquant la microscopie à fluorescence, nous avons été capables de visualiser le gradient pour faciliter sa mesure quantitative à travers 15. Dans cette étude, nous décrivons des méthodes détaillées pour la préparation chimiotactique HL60 (leucémie promyélocytaire humaine) cellules, suivi simultanément plusieurs chimiotaxie assays avec le dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire et la visualisation de la dynamique spatiotemporelle GPCR médiation par des molécules de signalisation telles que la protéine kinase D1 dans les cellules vivantes uniques en réponse à des stimuli chimiotactiques visibles, spatiotemporellement contrôlable. Nos méthodes d&#39;imagerie de pointe peuvent être appliqués à des études générales de chimiotaxie, et sont particulièrement appropriés pour des systèmes de cellules de mammifères.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td><td>Life technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scietific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES solution stérile, pH 7,3</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>A611-J848-06</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>NucleofectorTM 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V comprenant la solution NucleofectorTM, pipettes à usage unique, certifié AmaxaTM 100 ml aluminium cuvettes d’électrodes</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek chambré #1.0 Borosilicate Coverglass</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>solution de gélatine à 2 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks' Solution saline équilibrée)</td><td>Life technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enceintes de recouvrement Lab-Tek II à un puits</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Chambres de verre de protection Lab-Tek II à quatre puits</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-10438</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>F3506-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Épaisseur du verre de couverture (2) 22 mm x 22 mm</td><td>Corning</td><td>2855-22</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>MIC-1001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXICrope scannée (5 mm)</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>EZT-F01-5</td><td></td></tr><tr><td>1701RN 10 &mu ; l seringue</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II Embouts d’injection</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>TransferMan NK2, y compris module moteur, tête en X avec réglage d’angle et aides au positionnement.&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5188900056</td><td></td></tr><tr><td>DIAS software</td><td>Solltech Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 META ou microscope confocal équivalent avec un objectif à huile DIC Plan-Neofluar 40X 1.3 NA ou 60X 1.4 NA</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging g protein-coupled receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules hl60 neutrophiles comme

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Les cellules eucaryotes détectent et se déplacent vers un gradient de chimioattraction, un processus cellulaire appelé chimiotaxie. La chimiotaxie joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques, tels que l’embryogenèse, la structuration des neurones, les métastases des cellules cancéreuses, le recrutement des neutrophiles dans les sites d’inflammation et le développement de l’organisme modèle Dictyostelium discoideum. Les cellules eucaryotes détectent les attractifs chimiochimiques à l’aide de récepteurs couplés aux protéines G. Les tests de chimiotaxie visuelle sont essentiels pour mieux comprendre comment les cellules eucaryotes contrôlent la migration cellulaire directionnelle médiée par le chimioattractant. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour : 1) la surveillance en temps réel et à haute résolution de plusieurs tests de chimiotaxie, et 2) la visualisation simultanée du gradient de chimioattractant et de la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules HL60 de type neutrophile.

imagerie simultanée de la chimiotaxie des cellules HL60 multiples en utilisant la mobilité cellulaire dispositif d&#39;analyse Basé sur le principe de la microfluidique 16, le fabricant fournit des profils simulés de gradients: un gradient est produit en 1 min, stabilisée à moins de 5 min et maintenue pendant 2 heures. Les profils très prévisibles des gradients stables générés par microfluidiques permettent plusieurs dosages de chimiotaxie à effectuer simultanément. Dans la présente étude, nous avons observé trois essais de chimiotaxie simultanées (Figure 2A et film 1). Nous avons constaté que les cellules HL60 ont commencé chemotaxing immédiatement après la chimiotactique a été injecté dans le puits du chimiotactique, et gardé chemotaxing dans un chemin droit pour les 60 min suivantes, en accord avec les résultats de simulation pour la stabilité gradient. Tracer le chemin de Voyage et de la morphologiedes cellules permet des mesures quantitatives et la comparaison ultérieure des comportements de chimiotaxie en utilisant un indice de chimiotactisme qui inclut la longueur totale du trajet, la vitesse, la directionnalité et de circularité des cellules (figure 2B). La longueur totale du trajet correspond à la somme des longueurs des segments de droite reliant les centres de gravité de la trajectoire. La vitesse est obtenue en divisant la longueur totale du trajet du temps. Directionnalité est mesurée vers le haut et est définie comme suit: (coordonnée Y de fin de trajet moins coordonnée Y du début) divisée par la longueur totale du trajet. Cela donne 1,0 pour un objet se déplaçant directement vers le haut. La rondeur de la cellule est une mesure (en pour cent) de la façon dont efficacement zone une quantité donnée de périmètre entoure. Un cercle a la plus grande superficie pour tout périmètre donné et a un paramètre rotondité de 100%. Une ligne droite renferme aucune zone et a un paramètre rotondité de 0%. Nous démontrons le comportement de la chimiotaxie quantitativement mesurée comme décrit par les paramètres sélectionnés chimiotaxie(Figure 2C). Surveillance PKD localisation subcellulaire dans les cellules HL60 sous un stimulus fMLP spatiotemporellement visibles et contrôlables Il est un grand progrès technique marqué et appliquent une stimulation par fluorescence chimiotactique commandable pour un système expérimental. Historiquement, nous avons appliqué soit homogène (appelé aussi uniforme) la stimulation ou la stimulation gradient d&#39;observer la réponse et les comportements cellule. Toutefois, la stimulation «aveugle» fournit non seulement aucune information spatio-temporelle sur la façon dont le stimulus atteint les cellules, mais met aussi en doute les observations «anormales» de la réponse cellulaire à la stimulation, tout simplement parce que nous ne voyons pas le stimulus. Nous avons précédemment montré que le colorant fluorescent (Alexa594) peut être appliqué avec chimiotactique pour établir une relation linéaire entre la concentration chimiotactique et monitored intensité de colorant fluorescent 15. Avec une configuration d&#39;acquisition de la protéine fluorescente verte (GFP), une émission rouge de colorant fluorescent (Alexa594), et la lumière transmise, nous sommes en mesure de surveiller les cellules adhérentes, l&#39;application du stimulus, et la réponse cellulaire au stimulus (Figure 3A). La protéine kinase D est une famille de sérine / thréonine kinases , qui jouent un rôle essentiel dans la migration cellulaire dirigée 9,17. En réponse à la uniformément appliquée fMLP (rouge) la stimulation, les cellules HL60 la médiation d&#39; une translocation membranaire solide de GFP-étiquetée protéine kinase D1 (vert) (Figure 3B et film 2). Dans un gradient de fMLP (rouge) (figure 4A), les cellules HL60 recrutent activement PKD1 au bord d&#39; attaque (figure 4B et du film 3). Une comparaison étroite de la localisation subcellulaire de la GFP dans la saillie du bord d&#39;attaque indique que PKD1 localise à l&#39;arrière du bord d&#39;attaque (La figure 4C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> Figure 1. Cellule mobilité dispositif d&#39;analyse permet jusqu&#39;à 6 essais de chimiotaxie simultanés. (A) , le schéma montre la conception d&#39;une puce de dispositif d&#39;analyse de la mobilité cellulaire pour la surveillance simultanée de 6 essais de chimiotaxie indépendants. expositions rouges chimioattractant ajoutés aux puits. (B) L&#39; introduction de cellules HL60 aux puits de cellules tandis que le chimiotactique diffuse pour établir un gradient fMLP stable. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> Figure 2. La surveillance simultanée de plusieurs essais de chimiotaxie avec des cellules HL60. (A </strong&gt;) Montage montre des images de la mobilité cellulaire essai de chimiotaxie de dispositif d&#39;analyse pour examiner les effets inhibiteurs des inhibiteurs spécifiques de la PKD sur la chimiotaxie à des moments de 0 et 12 minutes après l&#39;application de gradient. cellules chimiotactique HL60 ont été pré-traitées avec un inhibiteur de PKD 1 uM CID755673 pendant 30 min. les cellules HL60 avec ou sans le traitement de l&#39;inhibiteur de PKD ont été autorisés à chemotax soit en milieu RPMI1640 de faim ou 100 nM de fMLP gradients de 12 min. (B) Schéma montre la longueur du trajet de Voyage et de la morphologie des cellules HL60 tracées. (C) Quantification de la chimiotaxie que la longueur totale du trajet, la vitesse, la directivité et la rondeur. Moyenne ± écart-type est représenté; n = 10, 12, ou 11 sans gradient, fMLP gradient sans traitement CID755673, et le traitement fMLP avec traitement CID755673, respectivement. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. GPCR-médiée robuste translocation membranaire de PKD1 en réponse à des stimuli fMLP uniformément appliqués. (A) suivi Multichannel de PKD1-GFP (vert), chimiotactique (1 uM fMLP mélangé avec 0,1 pg / ml colorant fluorescent Alexa 594, rouge) et DIC (contraste d&#39;interférence différentiel) afin d&#39;identifier les cellules HL60 adhèrent dans un puits d&#39;une chambre de 4well revêtu de gélatine à 0,2% dans du milieu RPMI 1640. Barre d&#39;échelle = 10 pm. (B) Montage montre que fMLP appliquée uniformément (rouge) induit robuste translocation membranaire de PKD1-GFP (vert). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> Figure 4. Le bord d&#39; attaque localisation de PKD1 dans chemotaxing cellules HL60. configuration d&#39;acquisition de mode (A) Canal facilite la visualisation du gradient fMLP et la dynamique spatiotemporelle des PKD1. Dans A - C, les cellules HL60 transitoirement exprimé PKD1 GFP-tagged; pour visualiser le gradient fMLP généré à partir d&#39; une micropipette (DIC), 100 nM de fMLP (rouge) ont été mélangés avec 0,1 pg / ml de colorant fluorescent Alexa 594. (B) , la localisation Enrichi de PKD1 au bord d&#39; attaque de la cellule de chemotaxing. Barre d&#39;échelle = 10 pm. (C) images fusionnées montrent que PKD1 localise à l&#39;arrière du bord d&#39; attaque dans les cellules HL60. Vert montre PKD1 localisation cellulaire, et l&#39;image DIC montre la zone en saillie du bord d&#39;attaque. Barre d&#39; échelle = 5 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

essais de chimiotaxie visuels sont essentiels pour une meilleure compréhension de la façon dont les cellules eucaryotes contrôler la migration cellulaire chimiotactique directionnelle médiée. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour: 1) en temps réel, la surveillance à haute résolution de plusieurs essais de chimiotaxie, et 2) visualisant simultanément le gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les cellules HL60 neutrophiles comme la signalisation.

Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

L'objectif général de ce modèle est de permettre la surveillance simultanée de plusieurs tests de chimiotaxie, ou la visualisation de plusieurs événements de signalisation d'une seule cellule en chimiotaxie. Les biologistes cellulaires d'Overdeck ont développé plusieurs approches différentes pour quantifier le comportement de chimiotaxie des cellules. Jusqu'à récemment, nous étions en mesure de répondre à des questions clés dans le domaine de la chimiotaxie, telles que : comment surveiller simultanément plusieurs tests de chimiotaxie.Le principal avantage de cette technologie réside dans l'application du principe de la microfluidique pour générer des ingrédients hautement reproductibles et fiables destinés à de multiples tests de chimiotaxie simultanés, avec une résolution élevée en temps réel. La procédure sera démontrée par le Dr. Xi Wen, post-doctorant de notre laboratoire. Pour assembler le support, utilisez d'abord les leviers afin de positionner la base en position verticale, de sorte que les leviers puissent s'incliner vers l'utilisateur.Ensuite, recouvrir brièvement la surface du verre de 41 millimètres avec de l'éthanol à 70 %, puis utiliser un chiffon pour éliminer soigneusement l'éthanol. Insérer le verre dans la base du support et placer une lame carrée de 2 millimètres recouverte de BSA sur le dessus du verre. Puis, insérer la petite joint torique dans la partie inférieure du boîtier de la plaquette et monter le boîtier dans la base du support, en orientant l'ouverture elliptique à l'arrière de l'appareil.Tirez le niveau intérieur de la base du support vers l'avant en position horizontale, afin de verrouiller le logement de la lame en place. Utilisez un nettoyeur à air pour éliminer tous les débris présents à l'intérieur du logement de la lame. Ajoutez ensuite 4 millilitres de milieu RPMI 1640, complété avec 0,1 % de BSA, au logement.Maintenant, montez la puce de l'appareil d'analyse de la mobilité cellulaire revêtue de BSA au centre du logement de la tranche, avec la face structurelle en contact avec le verre et la marque de positionnement à l'arrière. Insérez les deux ergots du joint en caoutchouc dans les trous pour fixer le joint sur la partie inférieure de la pince à tranche, puis placez le grand joint torique sur le dessus du logement de la tranche. Ensuite, montez la pince à tranche en plaçant le trou du capteur à l'arrière, puis tirez le levier extérieur de la base du logement vers l'avant en position horizontale afin de verrouiller la pince à tranche en place.Lorsque le support est assemblé, placez le fond du support sur une boîte lumineuse afin de vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les puits. Ensuite, retirez le couvercle, transférez l’ensemble sur la plaque située au-dessus de l’unité de dispositif d’analyse de la mobilité cellulaire, puis fixez le bloc capteur au support. Pour réaliser le test de mobilité cellulaire, commencez par suspendre les cellules HL60 différenciées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté en BSA, à une concentration de deux fois dix puissance six cellules par millilitre.Ensuite, connectez l'unité de l'appareil d'analyse de la mobilité cellulaire à l'ordinateur pour l'acquisition d'images, puis allumez les deux appareils. Ouvrez ensuite le logiciel de l'appareil d'analyse de la mobilité cellulaire. Dans le panneau de contrôle d'image de la caméra, utilisez les lignes horizontales et verticales pour ajuster en temps réel la position du support, et centrez l'appareil dans le panneau d'image de la caméra.Ensuite, sélectionnez le canal un pour déplacer la caméra vers le canal sélectionné, et utilisez Déplacer à gauche ou Déplacer à droite pour ajuster la coordonnée X de la caméra afin de centrer le champ de vision horizontalement. Pour ajuster verticalement l'image au centre de l'écran, tournez le bouton de position situé sur le panneau avant du dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Sur le panneau de contrôle du chauffage, réglez la température du support à 37 degrés Celsius et celle de la plaque à 39 degrés Celsius.Pour contrôler la température à l’aide du capteur thermique connecté au porte-objet, cliquez sur Chauffage pour démarrer le chauffage, puis sur Porte-objet. Sur le panneau de prise de vue, saisissez 15 secondes pour l’Intervalle et 30 minutes pour la Durée afin de définir respectivement les intervalles et la durée du test de chimiotaxie. Par mesure de sécurité, sélectionnez Éteindre le chauffage à la fin de la prise de vue.Ensuite, enregistrez le fichier, saisissez les détails de l'expérience dans le panneau de mémo et vérifiez que l'appareil est centré dans tous les canaux. Retirez maintenant tout le tampon du support, ainsi que huit microlitres de tampon du troisième puits en partant du haut du premier canal. À l’aide d’une seringue, injectez deux microlitres de cellules dans le deuxième puits du même canal, tout en surveillant l’écran en temps réel pour contrôler le nombre de cellules et le débit pendant l’injection.Lorsque les cellules sont alignées, ajoutez immédiatement les huit microlitres de tampon dans le puits, puis répétez l'injection des cellules dans les canaux deux à six, comme vient d'être démontré. Une fois toutes les cellules ajoutées, ajoutez deux millilitres de tampon dans le support et ajoutez un microlitre du chémoattractant dans le troisième puits à partir du haut dans les canaux appropriés. Enfin, démarrez l'acquisition d'images.Dans cette expérience représentative, les cellules HL60 commencent à chimiotacter selon un trajet rectiligne immédiatement après l'injection du chimioattractant, et poursuivent pendant les 60 minutes complètes du test, ce qui est conforme aux résultats de la simulation de stabilité du gradient. Le traçage du trajet parcouru et de la morphologie des cellules permet la mesure quantitative puis la comparaison ultérieure des comportements de chimiotaxie, à l’aide d’un indice de chimiotaxie incluant la longueur totale du trajet, la directionnalité, la vitesse et le degré de circularité des cellules. L’application d’un colorant fluorescent, conjointement au chimioattractant, permet d’établir une relation linéaire entre la concentration du chimioattractant et l’intensité fluorescente du colorant mesurée.En outre, en réponse à une stimulation par chimioprotéine uniformément appliquée, les cellules HL60 induisent une translocation membranaire robuste de la protéine kinase D1 marquée par la GFP. Dans un gradient de chimioprotéine, les cellules HL60 recrutent activement la kinase à l'arrière du bord avant. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette manipulation, il est essentiel de suivre strictement les instructions du fabricant concernant l'assemblage du porte-échantillon et de surveiller l'injection des cellules.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la chimiotaxie pour explorer la possibilité de multiples tests de chimiotaxie, tels qu'un système de dictyostélie monogénique ou d'autres types de systèmes cellulaires de mammifères. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'assembler l'appareil, d'effectuer simultanément des tests de chimiotaxie ou de visualiser simultanément plusieurs événements de signalisation dans des cellules chimiotactiques.

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