Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment cultiver et enregistrer l’activité électrophysiologique des neurones auditifs sur des réseaux multi-électrodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’audition, telles que la caractérisation des propriétés électrophysiologiques des neurones auditifs et la stimulation par les zones d’électrodes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’enregistrement simultané extracellulaire non invasif de l’activité neuronale d’un grand nombre de neurones auditifs.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie. En fait, ils pourraient être utilisés pour mettre en œuvre l’interface électroneurone de vos prothèses comme l’implant cochléaire pour restaurer l’audition chez les patients sourds. Pour commencer cette procédure, préparez la solution de revêtement ECM en décongelant d’abord le mélange ECM sur de la glace.

Ensuite, diluez le mélange ECM dans un milieu de culture de base dans un rapport de un à 10, et stockez-le sur de la glace. Pour les nouveaux AEM dans une hotte à flux laminaire, plongez-les dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes. Ensuite, lavez-les à l’eau distillée pendant 30 secondes.

Laissez ensuite sécher les MEA pendant 30 minutes. Pour enrober les MEA, pipetez 50 microlitres de solution d’enrobage sur les MEA avec une pointe de pipette froide de 200 microlitres. Laissez ensuite les MEA fonctionner pendant 30 minutes à une heure à température ambiante.

Après cela, retirez la solution de revêtement. Ajoutez 100 microlitres de milieu de culture complété par 10 % de FBS et cinq nanogrammes par millilitre de BDNF et laissez-le à température ambiante jusqu’à ce que le tissu soit placé. Ensuite, placez la boîte de Pétri contenant les MEA enrobés dans une grande boîte de Pétri et ajoutez une petite boîte de Pétri contenant du PBS pour l’humidification.

Dans cette procédure, stérilisez la tête du chiot avec de l’éthanol à 70 %. Coupez ensuite la connexion entre la peau et le crâne le long de la ligne sagittale. Ensuite, coupez le crâne de manière sagittaire et retirez le cerveau.

Après cela, coupez les os temporaux du crâne et placez-les dans une boîte de Pétri contenant du HBSS stérile et glacé. Sous un microscope de dissection, disséquez la bulle tympanique à l’aide d’une paire de pinces fines et isolez l’oreille interne. Ensuite, retirez l’os de la cochlée.

Ensuite, retirez le ligament spiralé et le SV ensemble en tenant la partie basale du ganglion spiralé et le SV avec une pince et en déroulant lentement le SV de la base à l’apex. Séparez l’organe de Corti du ganglion spiralé in modiolus en tenant la partie basale du ganglion spiralé et l’organe de Corti avec des pinces et en déroulant lentement l’organe de Corti de la base à l’apex. Ensuite, coupez les explants latéraux du ganglion spiralé à l’aide d’une pince ou de fines ciseaux ou couteaux de micro-dissection.

Transférez maintenant les explants du ganglion spiralé et l’organe de Corti sur le MEA. Ensuite, placez des explants SG sur la zone de l’électrode et l’organe de Corti à environ cinq millimètres de la zone de l’électrode. Placez les explants et l’organe de Corti sur les MEA tout en évitant d’endommager les tissus.

Ensuite, placez soigneusement les AEM dans l’incubateur et cultivez-les à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le lendemain, inspectez visuellement les explants pour vérifier leur fixation aux AEM. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture contenant 10 % de FBS et de BDNF par jour pendant cinq jours consécutifs.

Le sixième jour, ajoutez deux millilitres de milieu de culture contenant 10 % de FBS et cinq nanogrammes par millilitre de BDNF et cultivez le tissu pendant 13 jours supplémentaires. Après une culture collective de 18 jours, laver la culture MEA avec la solution extracellulaire préparée plus tôt à température ambiante. Ensuite, séchez les contacts de la puce MEA avec un morceau de tissu et montez les MEA sur le support MEA.

Enfin, installez le MEA sur la configuration d’enregistrement. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de la solution extracellulaire et attendez 10 minutes pour permettre au système de se stabiliser avant d’enregistrer. Maintenant, enregistrez l’activité spontanée pendant deux minutes de toutes les électrodes et identifiez les électrodes actives.

Ensuite, identifiez les électrodes qui répondent à la stimulation. Pour exclure l’artefact de stimulation, stimulez 10 fois à partir de la même électrode. Si la culture répond au moins huit fois sur 10, on peut supposer qu’il s’agit d’une réponse positive lors de la stimulation induite par les électrodes.

Pour identifier un bruit de fond, appliquez du TTX sur la culture à une concentration d’une micromolaire pour bloquer les canaux sodiques voltage-dépendants, puis enregistrez pendant deux minutes. Voici les traces des enregistrements originaux de six des 63 électrodes qui montrent une activité spontanée et voici le tracé matriciel des six électrodes après détection de pointe. Chaque barre représente un potentiel d’action.

Ce graphique matriciel inclut toutes les électrodes actives. Les activités sont enregistrées à partir de 63 électrodes pendant deux minutes. Cette figure illustre qu’un stimulus biphasique d’une durée totale de 80 microsecondes et d’une amplitude de 80 microampères a été utilisé pour la stimulation de la culture à partir d’une électrode.

Cet exemple représentatif de traces de données brutes montre les potentiels d’action, le tout sans réponses après stimulation. Et voici la culture ganglionnaire spiralée sur les MEA immuno-colorée pour le marqueur neuronal, TUJ, à la fin de l’expérience pour visualiser la couverture neuronale de la zone de l’électrode. L’électrode utilisée pour la stimulation est indiquée en vert et les électrodes répondantes sont indiquées en rouge.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 50 minutes si elle est correctement exécutée. Bien que ces méthodes puissent donner un aperçu de l’électrophysiologie des neurones du ganglion spiral, elles peuvent également être appliquées à d’autres systèmes tels que les cultures de cerveau ou de moelle épinière. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la science des matériaux et de la nanotechnologie, de la modification de surface par transfert rapide des électrodes d’enregistrement neuronal et de stimulation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et d’enregistrer l’activité électrophysiologique, en organisant une explantation de neurones sur des réseaux de multiélectrodes.