Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d'anticorps par-enzymatique lectine Assay

L’objectif global de ce test de lectine enzymatique est de mesurer les titres d’anticorps fonctionnels contre la neuraminidase, une glycoprotéine à la surface du virus de la grippe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des vaccins, telles que : Y a-t-il une réponse anticorps à la neuraminidase après la vaccination contre la grippe ou l’infection ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une plate-forme pratique pour mesurer les titres d’inhibition de la neuraminidase dans un grand nombre d’échantillons de sérum.

Des virus grippaux réassortis contenant la neuraminidase d’intérêt et une hémagglutinine du sous-type H6 sont utilisés dans l’ELLA. Cela empêche l’interférence des anticorps contre l’hémagglutinine contenue dans le vaccin ou le virus infectieux A infectieux. Travailler avec des virus grippaux H6 réassortis vivants nécessite un permis et une manipulation selon des procédures renforcées de niveau de biosécurité 2.

Les virus réassortis H6 qui ont été inactivés chimiquement peuvent être utilisés dans le dosage. Un virus H6N2 inactivé est utilisé dans cette démonstration. Préparez les dilutions virales dans une plaque à 96 puits en distribuant d’abord 120 microlitres de diluant de l’échantillon dans les colonnes 1 à 11 de la plaque de dilution.

À la colonne 1, ajoutez 96 microlitres supplémentaires de diluant de l’échantillon. Décongelez puis vortex la fiole de virus avant d’en ajouter 24 microlitres dans un puits de la colonne 1. Cela donne une dilution de 1:10 du virus.

Effectuez des dilutions répétées en deux fois du virus dans le diluant de l’échantillon en transférant 120 microlitres d’un puits à l’autre, en utilisant des pointes de pipette propres pour chaque dilution. Ensuite, lavez trois fois une assiette recouverte de fétuine avec du PBS-T. Ensuite, épongez chaque assiette sur une serviette en papier absorbante pour éliminer tout excès de tampon de lavage.

Ajouter 50 microlitres de diluant d’échantillon dans chaque puits des colonnes 1 à 11 de la plaque revêtue de fétuine. Ajouter 100 microlitres de diluant de l’échantillon à la colonne 12 pour le témoin négatif. Transférez 50 microlitres de virus dilué des colonnes 1 à 11 de la plaque de dilution vers des puits dupliqués de la plaque revêtue de fétuine.

Tapotez doucement pour mélanger. Et puis couvrez la plaque avec une scelleuse de plaques. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius.

16 à 18 heures plus tard, transférez la plaque sur le banc et retirez la scelleuse de plaques. Lavez l’assiette six fois avec du PBS-T, puis retournez-la et tapotez-la sur du papier absorbant pour vous assurer que tout le liquide a été retiré des puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres par puits de solution de peroxydase d’agglutinine d’arachide et de raifort dans tous les puits et incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante.

Moins de 15 minutes avant la fin de l’incubation, préparez la solution d’OPD. Lavez les plaques de test trois fois pour retirer le PNA-HRPO et séchez-les avant d’ajouter 100 microlitres de substrat OPD dans chaque puits. Incuber la plaque dans l’obscurité pendant exactement 10 minutes à température ambiante.

Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres par puits d’un acide sulfurique normal. Utilisez un lecteur de plaques pour mesurer la densité optique, ou DO, à 490 nanomètres pendant 0,1 seconde. Ensuite, sélectionnez la dilution du virus qui sera utilisée pour la sérologie, comme décrit dans le protocole textuel ainsi que dans la section des résultats.

Il est essentiel de sélectionner une dilution dans la plage linéaire de la courbe de titrage du virus. Nous préférons une dilution qui donne un signal proche du maximum afin d’utiliser toute la plage de dosage. L’ELLA est effectuée après avoir déterminé la dilution du virus nécessaire au dosage.

Pour commencer, préparez les réactifs et les matériaux de départ comme décrit dans le protocole de texte. Chauffez et activez les échantillons de sérum dans un bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes. Décongelez un flacon de virus, vortex, et mettez-le en suspension dans le diluant de l’échantillon à la dilution choisie.

Préparez au moins cinq millilitres de virus pour chaque plaque de dosage. Conservez le virus dilué sur de la glace jusqu’à ce que les plaques soient lavées et que des échantillons de sérum aient été ajoutés à la plaque. Préparez des dilutions des échantillons de sérum et de tous les témoins en effectuant des dilutions en deux séries dans une plaque à fond rond de 96 puits, en commençant par une dilution d’une sur dix dans le diluant de l’échantillon.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 50 microlitres de chaque contrôle sérique ou dilution d’échantillon de la plaque de dilution dans des puits dupliqués d’une plaque lavée recouverte de fétuine. Les dilutions de l’échantillon doivent être ajoutées dans les colonnes 2 à 11. Ajouter 50 microlitres de virus dilué dans tous les puits, à l’exception du témoin négatif de la colonne 12.

Ajoutez 50 microlitres de diluant d’échantillon dans les puits de la colonne 1 et ajoutez 100 microlitres de diluant d’échantillon dans la colonne 12. Couvrez les puits avec une scelleuse à plaques puis mélangez en tapotant doucement les côtés de la plaque ou en la plaçant sur un agitateur à plaque à vitesse modérée pendant 10 secondes. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures.

Lorsque l’incubation est terminée, laver la plaque avant d’ajouter le PNA-HRPO et terminer le test comme précédemment. Lisez la densité optique à 490 nanomètres et confirmez que les résultats du test sont valides. Déterminez le titre final de 50 % comme décrit dans le protocole texte et la section des résultats.

Pour sélectionner la dilution virale qui sera utilisée pour la sérologie, un graphique qui trace la valeur de DO à 490 nanomètres à chaque dilution du virus est généré. La DO maximale forme un plateau aux dilutions virales les plus faibles. Sélectionnez la dilution du virus qui donne environ 90 % du signal maximal et qui se situe dans la plage linéaire.

Confirmez que la DO à la dilution sélectionnée est au moins dix fois supérieure au signal de fond. Il s’agit de la dilution virale choisie pour les ELLA qui utilisent ce stock de virus particulier. Les résultats représentatifs d’un dosage enzymatique de la lectine montrant le pourcentage d’inhibition de l’activité de la neuraminidase calculé pour chaque dilution sérique sont présentés.

La dilution sérique est tracée sur une échelle logarithmique, comme le montre ce graphique. Identifier la dilution sérique qui a entraîné une inhibition supérieure ou égale à 50 % de l’activité de la neuraminidase. Dans cet exemple, la dilution de 1 sur 160 du sérum a entraîné une inhibition de 74 %, et la dilution de 1 sur 320 du sérum a entraîné une inhibition de 45 %.

Le titre d’inhibition de la neuraminidase est donc de 160. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les différences antigéniques dans les neuraminidases des virus de la grippe saisonnière. L’ELLA a également été utilisé pour démontrer que les anticorps inhibiteurs de la neuraminidase sont corrélés à la protection contre les signes cliniques de la grippe.