Name: Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'analyse des rythmes circadiens chez Arabidopsis par imagerie luminescente de protoplastes transfectés. Cette technique évite la création de lignées transgéniques stables et accélère l'étude des mutants.

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Nous tenons à remercier le Prof. David Somers et le Dr. Jeongsik Kim pour le plasmide rapporteur de la luciférase et le développement initial de la méthode. Prof. Karen Halliday a aimablement fourni toutes les lignées mutantes circadiennes utilisées dans cette étude. Cette recherche a été financée par des subventions de recherche de la Royal Society RS120372 et RS140275. GvO est chercheur à la Royal Society University Fellow (UF110173).

NOTE: Dans ce protocole, les réactifs et les volumes décrits sont exprimés par ligne de Arabidopsis qui est testée, et se traduira par six puits réplicats pour ce génotype. Multipliez les matériaux avec le nombre de lignes à analyser lors de l&#39;analyse plus d&#39;une ligne. Dans la vidéo, de type sauvage Arabidopsis sera comparée à l&#39;horloge circadienne mutant ZTL ligne (bien que des résultats représentatifs des lignes supplémentaires seront fournies ultérieurement). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> solution enzymatique </td><td></td></tr><tr><td> Cellulase </td><td> 0,5% (p / v) </td></tr><tr><td> Pectinase R10 </td><td> 0,25% (p / v) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM, </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 20 mM, </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> 0,1% (p / v) </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 20 mM, </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solution W5 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solution MMg </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5,7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 15 mM, </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> solution de PEG </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40% (p / v) </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution d&#39;imagerie </td><td></td></tr><tr><td> solution W5 </td><td> au volume final </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Luciferin </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> ampicilline </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Liste des solutions. 1. Préparation des matériaux et Tampons <ol><li> Les matières végétales <ol><li> Maintenir Arabidopsis Col -0 graines dans l&#39; eau dans un tube de 1,5 ml à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant quatre jours. Pipeter les graines sur le sol dans une casserole et transférer à des conditions de jours longs (16 heures de lumière 8 h d&#39;obscurité) à 21 ° C pendant 7 jours. Laisser un couvercle sur le pot pour les trois premiers jours pour assurer une forte humidité. Transplant six plants à une nouvelle 8 cm x 13 cm x 5 cm pot et continuer à cultiver les plantes dans les mêmes conditions pour another 21 jours. Assurez-vous que le sol est humide tout au long. </li></ol></li><li> Reporter plasmide <ol><li> Purifier le CCA1pro: LUC plasmide rapporteur 19 de la culture bactérienne à l&#39; avance, en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN selon les instructions du fabricant. NOTE: 20 ug plasmide rapporteur est nécessaire (10 pi à 2 pg / pl dans dH 2 O) pour une transfection. </li></ol></li><li> Solutions NOTE: Pour ce protocole cinq solutions sont nécessaires: la solution enzymatique, Wash 5 (W5) solution, mannitol-Magnésium (MMG) solution, le polyéthylène glycol (PEG) solution, et une solution d&#39;imagerie (tableau 1). Préparer ceux-ci avant de procéder à l&#39;étape d&#39;isolement de protoplastes. <ol><li> Préparer 10 ml de solution d&#39;enzyme selon le tableau 1, en ​​ajoutant les enzymes dernier et stériliser par filtration la solution à travers un filtre de 0,22 um seringue. </li><li> Préparer les solutions restantes dans les volumes suivants: 15 ml W5 solution, 10 ml MMg solution, 1 ml de solution de PEG et d&#39;une solution d&#39;imagerie de 1,5 ml selon le tableau 1. Remarque: il est important que la solution de PEG est préparé au moins une heure avant la transfection pour assurer que le PEG est complètement dissous. Stériliser par filtration la solution de formation d&#39;image à travers un filtre à seringue de 0,22 um. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Figure 1:. Protoplastes isolement Les feuilles des plantes d&#39;Arabidopsis adultes (A) sont fixés sur la bande autoclave avec la couche inférieure de l&#39; épiderme vers le haut (B). (C) Magic Tape est doucement pressée sur la couche inférieure de l&#39; épiderme avec la pointe d&#39;un tube de 15 ml conique. (D) La bande magique est enlevée pour exposer les cellules du mésophylle (E). (F) Des bandes de ruban autoclave avec la permissions ci-joints sont flottés sur une solution enzymatique contenant de la cellulase et de la pectinase, la libération des protoplastes dans la solution. (G) La feuille squelettes restent sur ​​la bande autoclave après digestion par enzyme et sont mis au rebut, ce qui laisse les protoplastes dans une solution enzymatique (H). (I) protoplastes finales résultant de mésophylle (barre d&#39; échelle = 50 pm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. protoplastes Isolation <ol><li> Etiqueter une boîte de Pétri et ajouter 10 ml de solution d&#39;enzyme stérilisée par filtration. </li><li> Fixer quatre bandes de ruban autoclave avec le côté collant sur une surface de laboratoire propre, et marquer la taille de la boîte de Pétri sur les bandes. </li><li> Couper les feuilles de 4 semaines vieilles plantes (figure 1a), et appuyez sur l&#39;épiderme supérieur sur la bande d&#39;autoclave ( à savoir la surface de l&#39; épiderme inférieur vers le haut ( <strong&gt; Figure 1b)). </li><li> Appuyez doucement sur des bandes de ruban magique sur la surface de l&#39;épiderme inférieur à l&#39;aide d&#39;un tube de 15 ml conique. Prenez soin de ne pas écraser le tissu foliaire (Figure 1c). Retirez délicatement le ruban magique hors de dépouiller l&#39;épiderme inférieur (Figure 1d) et exposer les cellules du mésophylle (Figure 1e). </li><li> Couper le ruban autoclave pour ajuster la boîte de Pétri, utiliser des pinces pour déplacer la bande dans la boîte de Pétri et flotter sur la solution d&#39;enzyme (Figure 1f), les feuilles vers le bas. Tourner à 60 tours par minute sur un agitateur à plate-forme pendant 60 minutes, au cours desquelles les protoplastes sont libérés dans la solution. </li><li> Utilisez des pinces pour enlever et jeter les bandes de ruban autoclave (Figure 1g) et la pipette la solution contenant les protoplastes (Figure 1h) dans un tube conique de 50 ml. Utiliser un embout de pipette grand alésage (comme une pointe de P5000 ou une pointe de P1000 avec l&#39;extrémité coupée). </li><li> Centrifuger les protoplastes à 100 xg pendant 3 min à 4 ° C et à retirer le surnageant avec une pipette. Prenez garde, car le culot est très lâche. </li><li> Ajouter une solution de W5 10 ml aux protoplastes et resuspendre en remuant doucement le tube. </li><li> Reposez les protoplastes sur la glace pendant 30-60 min. Au cours de cette étape, d&#39; évaluer le rendement en comptant les protoplastes dans un hémocytomètre (Figure 1i). </li><li> Recueillir les protoplastes par centrifugation à 100 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Prenez garde, car le culot est très lâche. </li><li> Remettre en suspension les protoplastes à une concentration de 5 x 10 5 protoplastes / ml dans une solution MMG. </li></ol> 3. protoplastes Transfection <ol><li> Ajouter 10 ul plasmide rapporteur (2 pg / pl) dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Ajouter 400 ul de protoplastes dans le tube. </li><li> Ajouter un volume (410 pi) solution de PEG et mélanger en inversant le tube doucement 12 fois pour transfecter les protoplastes. </li><li> Après 8-15 min incubation à la température ambiante, on dilue le mélange protoplastes ADN-PEG avec quatre volumes (1640 pi) mélanger la solution W5 et en retournant doucement à six reprises. </li><li> Recueillir les protoplastes transfectées par centrifugation à 100 g pendant 2 min à température ambiante et retirer le surnageant avec une pipette. Encore une fois, prendre soin, comme le culot est très lâche. </li><li> Resuspendre les protoplastes dans 1.250 solution d&#39;imagerie ul. </li><li> Aliquoter 200 pi dans six répliquent puits d&#39;une plaque à 96 puits, remplir tous les puits vides avec une solution W5, et sceller la plaque avec un couvercle transparent adhésif approprié pour l&#39;imagerie luminescente. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Transférer la plaque pour toute installation d&#39;imagerie luminescente appropriée pour l&#39;imagerie végétale. Changez les couvercles adhésifs sur les plaques 10-15 minutes après le transfert pour éviter la condensation et la pression des différences entre les puits, puis commencer à l&#39;imagerie. Lire la plaque tous les ~ 45 min (3 sec par puits) pendant cinq jours à la température ambiante. Noter lala fréquence de la plaque de lecture et le temps de lecture par puits peut varier en fonction de la configuration de l&#39;imagerie. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> Analyser les résultats de luminescence en utilisant un logiciel d&#39;analyse (par exemple, biologique Rhythms système logiciel d&#39; analyse (BRASS) 22). Comparer la ligne mutant à des contrôles de type sauvage pour révéler les défauts circadiens. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un test rapide à l&#39;écran circadiens défauts d&#39;époque dans des lignées d&#39;Arabidopsis, y compris l&#39;isolement de protoplastes, la transfection, et l&#39;imagerie par luminecent. La période circadienne de type sauvage Arabidopsis et l&#39;horloge mutants CCA1 / lhy, ZTL et CCA1 -OX a été calculé à partir des mesures de luminescence d&#39;un CCA1pro: reporter LUC et jugée compatible avec les données publiées générées à partir de plantes entières à l&#39; aide de plus Time- consommant des approches transgéniques (tableau 2). L&#39;utilisation de ce test pour cribler des mutants d&#39;Arabidopsis évite l&#39;exigence initiale pour générer des lignées transgéniques luminescentes, ce qui prend du temps et peut ne révéler qu&#39;un mutant particulier présente des rythmes de type sauvage. Un avantage évident de ce protocole est que toute ligne de Arabidopsis peut être projeté en peu de temps pour les rythmes circadiens de transcription modifiés, ce qui permettra l&#39;identification de plusieurs gènes affectant timekeeping dans les plantes. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Isolation des protoplastes peut être laborieux, surtout si la ligne mutant affiche un phénotype nain. Des procédés rapportés précédemment pour produire des protoplastes de coupe comportent des feuilles ou des plants en fines lamelles et le vide qui infiltrent les plaques avec une solution d&#39;enzyme pour permettre aux enzymes d&#39;atteindre les parois cellulaires 26,27. La digestion ultérieure nécessite au moins 3 heures d&#39;incubation dans l&#39;obscurité pour libérer les protoplastes dans la solution enzymatique. Lorsque l&#39;infiltration sous vide est pas appliquée, la durée d&#39;incubation jusqu&#39;à 18 heures est conseillé. Dans le protocole présenté ici, l&#39;infiltration sous vide est inutile car la couche cellulaire épidermique impénétrable aux enzymes est enlevé par la bande. Lors de la génération des protoplastes en coupant le matériel végétal, il est nécessaire de protoplastes séparer les débris de la paroi cellulaire après digestion; ceci est généralement fait par filtration de la solution ou de la purifier sur un 27,26 gradient de sucre. Ici, tout tissu non digérés restera sur la bande d&#39;autoclave aprèsla digestion, de sorte que la filtration et la purification du sucre gradient des protoplastes peut être omise. Il y a une chance que le stress résultant de procédures de protoplastes prolongées affecte la viabilité cellulaire et l&#39;horloge circadienne. La méthode de protoplastes sur bande 20 visualisés ici donne un nombre élevé de protoplastes; et compte tenu de la viabilité des cellules au cours d&#39; une série temporelle du rythme circadien et les longueurs des périodes correspondantes de protoplastes et de plants entiers (tableau 2), la méthode décrite ici , on préfère plus d&#39; autres méthodes pour générer des protoplastes. L&#39;étape de transfection du protocole est une étape critique qui a un impact sur la viabilité des protoplastes. La solution de PEG permet à l&#39;ADN qui doit être délivré dans la cellule, et à la fois du temps d&#39;incubation dans cette solution (étape 3.4) et le pourcentage du PEG doit être déterminée de manière empirique. La concentration standard est de 20%, avec des concentrations plus faibles en réduisant l&#39;efficacité de la transformation ultérieure etLes concentrations en réduisant la viabilité 28. Temps aussi court que cinq minutes d&#39;incubation pourrait donner une transfection efficace des protoplastes 27. Les protoplastes peuvent être visualisés sur une plate-forme d&#39;imagerie luminescente. Dans cette vidéo, nous avons utilisé un lecteur de plaque de luminescence équipée avec des lumières extérieures (rouge et LED bleues, 630 et 470 nm, respectivement, à une intensité combinée de ~ 20 uE), qui permet le criblage à haut débit et des mesures fréquentes. Autre équipement d&#39;imagerie qui détecte la luminescence, tels que les lecteurs ou les configurations de plaques alternatives basées autour d&#39;un dispositif (CCD) à couplage de charge, pourrait être appliquée aussi bien aussi longtemps que l&#39;éclairage est disponible pour la photosynthèse. L&#39;avantage d&#39;utiliser une caméra CCD monté sur un meuble commandé est que la lumière et la température peut être programmé. Un inconvénient est le temps de capture plus, l&#39;introduction de longues périodes d&#39;obscurité qui peut causer un stress aux protoplastes en plus perturberaiting timekeeping endogène. Quelle que soit la plate-forme expérimentale est choisie, le réglage des paramètres est susceptible d&#39;être nécessaire par rapport aux paramètres pour les semis ou les plantes matures. Dans notre expérience, ce qui augmente les concentrations de plasmide rapporteur pendant la transfection et / ou luciférine dans le tampon d&#39;imagerie peut résoudre tous les rythmes erratiques ou d&#39;amortissement rapide qui pourraient survenir dans les premières expériences. Dans des expériences futures, la méthode décrite ici peut être appliquée à l&#39;étude du phénotype circadien d&#39;une ligne d&#39;Arabidopsis mutante. Avec des modifications mineures, par exemple l&#39;effet de divers médicaments sur timekeeping pourrait être étudié dans cette configuration. En outre, la transfection peut être modifié pour inclure microARN artificiel pour silençage génique 19, élargissant ainsi la polyvalence de ce protocole. Protocoles pour générer des protoplastes de riz sont bien établies 29 et le protocole d&#39;imagerie présentées ici pourraient également être appliqués pour faire avancer notre uCOMPRENDRE de l&#39;horloge dans économiquement importantes plantes cultivées monocotylédones.

La plupart des organismes vivants possèdent un chronométreur endogène pour faciliter la négociation efficace des changements quotidiens dans l&#39;environnement. Cette chronométreur, l&#39;horloge circadienne, régule de nombreux aspects du métabolisme et la physiologie d&#39;un organisme d&#39;anticiper les changements prévisibles dans l&#39;environnement externe. Chez les plantes , par exemple, l&#39; anticipation des agents pathogènes ou herbivore attaques temporellement prévisibles réduit fortement la sensibilité globale 1-4. Le métabolisme de l&#39; amidon est étroitement régulée par l&#39;horloge circadienne pour assurer que les réserves d&#39;amidon jusqu&#39;à l&#39; aube si cultivé dans des conditions longues ou courtes jour 5. En effet, les plantes avec des horloges circadiennes correspondant aux environnement montrent une augmentation des taux de croissance de 24 h, le taux de fixation de carbone et les taux de survie par rapport aux plantes en cours d&#39; exécution d&#39; une horloge de la période dépareillés 6. L&#39;influence étendue des rythmes circadiens dans tous ces processus se présente dans une large mesure de la régulation rythmique jusqu&#39;à un tiersdu transcriptome total Arabidopsis 7. Ces produits de gènes rythmiques sont impliqués dans un large éventail de processus cellulaires , y compris les voies métaboliques, la signalisation hormonale, et le stress des réponses 7. En plus de cela, la régulation circadienne directe de la fonction des protéines est établie par régulation circadienne de la phosphorylation 8 et plus probablement d&#39; autres modifications post-traductionnelles (PTM). Au centre de l&#39;horloge circadienne qui entraîne cette reprogrammation transcriptionnelle quotidienne est un réseau de transcription / feedback translationnelle boucles (TTFLs), y compris les gènes du matin exprimé CIRCADIEN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) et TARD ELONGATED HYPOCOTYLE (LHY) qui répriment l&#39;expression des gènes du soir TIMING dE CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) et les membres du complexe du soir (CE); LUX ARRHYTHMO (LUX), floraison précoce 3 (ELF3), et ELF4 9 - 11. wit Ensembleh les -Genès REGULATEUR PSEUDO DE RÉPONSE (pRR3, 5, 7 et 9), TOC1 refoule CCA1 / expression LHY alors que la CE agit comme un régulateur positif 12-14. Additionnel à des mécanismes de rétroaction, post-transcriptionnelle et post-traductionnelle régulation des composants du réseau TTFL joue un rôle important dans les rythmes circadiens tuning. À ce jour, le PTM le plus abondant identifié sur les protéines de l&#39; horloge circadienne est la phosphorylation 15. La phosphorylation de CCA1 par Casein Kinase 2 (CK2) affecte sa liaison à cibler les promoteurs 16 et est important pour la compensation de température de l&#39;horloge circadienne 17. Les protéines PRR sont phosphorylés différentiellement au cours du cycle circadien, et la phosphorylation de TOC1 affecte l&#39; interaction avec son régulateur négatif, le composant d&#39;horloge Zeitlupe soir phases (ZTL) 18. Ces exemples illustrent comment PTM et les interactions protéine-protéine syntoniser le réseau TTFL dans un h 24l&#39;oscillateur de la transcription. Pour une présentation plus détaillée au réseau d&#39;horloge de la transcription et de sa régulation, d&#39; excellentes critiques récentes sont disponibles (par exemple , référence 15). Cependant, ce qui reste moins clair est la mesure dans laquelle les processus réglementés rythmiquement et d&#39;autres aspects du métabolisme cellulaire se nourrissent de nouveau dans le mécanisme de chronométrage lui-même. Vaste sélection de mutants d&#39;Arabidopsis pour les défauts d&#39;horloge pourrait obtenir une meilleure compréhension des mécanismes qui ou les voies de signalisation pourraient être impliqués dans la génération de 24 rythmes h à partir d&#39;un réseau de TTFL. À cette fin, Kim et Somers précédemment publié une méthode de percée pour l&#39;analyse efficace et rapide de la fonction d&#39;horloge dans une ligne de Arabidopsis 19. Sur la base de l&#39;utilisation de l&#39;expression transitoire dans des protoplastes, cette méthodologie surpasse le besoin de lignées transgéniques stables ou centre pour lignes de marquage d&#39;horloge luminescentes. Ici, nous visualisons un protoplaste isolatio à haut rendementn procédé 20 combiné avec un protocole optimisé pour cribler des défauts circadiens imagerie par luminescence des marqueurs d&#39;horloge exprimés transitoirement dans un lecteur de plaque à 96 puits. Nous allons comparer type sauvage Col- 0 Arabidopsis à des mutants d&#39;horloge bien caractérisés pour confirmer la méthodologie décrite ici avec succès détecte les rythmes circadiens altérés. Protoplastes dérivés de ces lignes sont transfectées avec une construction de rapporteur qui exprime la luciférase de luciole à partir du promoteur DPA1 circadien; CCA1pro: LUC 19. Luciférase catalyse la réaction en plusieurs étapes dans lequel luciférine est converti excité électroniquement oxyluciférine qui émet de la lumière 21, qui est imagé au fil du temps pour évaluer la période, l&#39; amplitude et la phase des rythmes de transcription dans ces protoplastes. Le protocole est constitué de trois parties principales; l&#39;isolement des protoplastes, transfecter des protoplastes avec le plasmide rapporteur et im luminescentvieillissement. Ces trois parties doivent toujours être effectuées sur un seul jour, en utilisant des tampons et des réactifs fraîchement préparés. La croissance des plantes et la purification de quantités suffisantes de plasmide rapporteur doivent être effectués à l&#39;avance et ne sont pas visualisées dans ce protocole.

<table><tbody><tr><td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&nbsp ; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Dissoudre la poudre de luciférine dans un tampon trisphosphate 0,1 M pH 8,0 jusqu’à une concentration de 50 mM</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Ruban indicateur de vapeur</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magic Tape</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque, 96 puits, fond plat, blanc</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, couvercles adhésifs pour plaques 96 puits</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>seringue, 10 ml, sans aiguille</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0,22 & micro ; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Téléchargement gratuit sur amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage de Fuch-Rosenthal modifiée, double cellule</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à champ clair</td><td>Optika Microscopes</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 Lecteur multimode TriStar2, avec module de luminescence</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse rapide des phénotypes circadiens dans arabidopsis protoplastes transfectées avec un luminescent clock reporter

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

L’horloge circadienne végétale permet d’anticiper les changements quotidiens de l’environnement. Cette anticipation aide les réponses aux stress biotiques et abiotiques prévisibles dans le temps. À l’inverse, la perturbation de la mesure du temps circadien compromet gravement la santé des plantes et réduit les rendements des cultures agricoles. Il est donc impératif que nous comprenions la régulation complexe des rythmes circadiens chez les plantes, y compris les facteurs qui affectent le mouvement de l’horloge transcriptionnelle elle-même.
Le test des défauts circadiens chez la plante modèle Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) implique traditionnellement le croisement de lignées mutantes spécifiques vers une lignée exprimant rythmiquement la luciférase des luciférases à partir d’un promoteur de gène de l’horloge circadienne. Cette approche est laborieuse, prend du temps et peut être infructueuse si un mutant n’a pas de phénotype circadien. La méthodologie présentée ici permet une première évaluation rapide des phénotypes circadiens. Des protoplastes dérivés d’Arabidopsis mutants et de type sauvage sont isolés, transfectés avec un rapporteur luminescent exprimé rythmiquement et imagés dans des conditions de lumière constante pendant 5 jours. Des traces luminescentes révéleront directement si la période de libre circulation des plantes mutantes est différente de celle des plantes de type sauvage. L’avantage de la méthode est que n’importe quelle ligne d’Arabidopsis peut être filtrée efficacement, sans qu’il soit nécessaire de générer une ligne de marqueur d’horloge luminescente transgénique stable dans ce fond mutant.

Protoplastes de type sauvage Arabidopsis ont été comparés aux mutants d&#39;horloge connus CCA1 / lhy (courte période mutant 2), ZTL (long mutant de la période 23), et la ligne de surexpression CCA1 -OX (arythmique 24). Tous ont été transitoirement transfectées avec le CCA1pro: reporter GCU et imagé à la lumière constante sur un lecteur de plaque sur 5 jours. Ici , nous montrons que , dans le mutant CCA1 / lhy, la période de libre-exécution de l&#39; expression circadienne contrôlée gène est réduite (figure 2a), en ligne avec la période publiée analysée par expression transgénique stable de l&#39; horloge luminescent marqueurs 2,9. La période des oscillations circadiennes dans les protoplastes du mutant ZTL est plus long que dans le type sauvage (figure 2b), en conformité avec les résultats publiés antérieurement à partir de semis, suspension cellulaire cultures et protoplastes 19,23,25. La surexpression de CCA1 verrouille l&#39;horloge du matin phase et la transcription mondiale devient arythmique 24. Constamment, nous avons observé aucune oscillation dans CCA1pro: expression LUC en protoplastes -OX de CCA1 (figure 2c). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Figure 2: protoplastes Circadian Rhythms protoplastes de Col- 0, CCA1 / lhy, ZTL et CCA1 -OX ont été transitoirement transformé avec le CCA1pro: GCU construire et les rythmes circadiens dans la luminescence ont été imagées sur 5 jours (A - C). (D) estimations de la période circadiens basées sur les traces de luminescence dans le Col -0, CCA1 / lhy et ZTL (A - B). Moiun SEM ±, n = 3-5, t-test p-valeur comme indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Génotype </td><td> Période (protoplastes) </td><td> Période (transgénique) </td><td> Rapporté par: </td><td> Les références </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23,0 ± 0,21 </td><td> 24,4 ± 0,09 </td><td> pCCA1: LUC à Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> CCA1 / lhy </td><td> 20,6 ± 0,13 </td><td> 19,9 ± 0,11 </td><td> pCCA1: LUC à Col -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> ARN dans L er fond </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25,1 ± 0,12 </td><td> 27,4 ± 0,5 </td><td> CAB2: LUC en C24 écotype </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td> arythmique </td><td> arythmique </td><td> pCCA1: GCU (données LD uniquement) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> arythmique </td><td> ARN et de protéines dans le col de l&#39;arrière - plan </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tableau 2: les rythmes circadiens dans protoplastes Par rapport à Transgenic plantules La période circadienne de pCCA1:. Expression LUC en protoplastes par rapport aux longueurs de période rapportées pour la mutation et, si possible, avec pCCA1: expression LUC à Col -0.

L&#39;horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d&#39;Arabidopsis en utilisant l&#39;imagerie luminescente d&#39;un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

L'objectif général de ce test consiste à déterminer la période circadienne chez des lignées d'Arabidopsis en mesurant la luminescence émise par des protoplastes transfectés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie circadienne, telles que les gènes qui rétroagissent sur le mécanisme d'horloge lui-même. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une analyse rapide de la période circadienne de tout mutant d'Arabidopsis, sans nécessiter la création de lignées transgéniques stables.Pour commencer cette procédure, étiquetez une boîte de Pétri et ajoutez-y 10 millilitres de solution d'enzyme filtrée et stérilisée. Fixez quatre bandes de ruban autoclave avec le côté adhésif vers le haut sur une surface de laboratoire propre, puis marquez la taille de la boîte de Pétri sur les bandes. Récupérez les plants depuis la chambre de croissance.Couper les feuilles de plantes âgées de quatre semaines et appuyer l'épiderme supérieur contre du ruban adhésif pour autoclave, de sorte que la surface épidermique inférieure soit orientée vers le haut. Appliquer des bandes de ruban adhésif magique sur la surface épidermique inférieure. À l'aide d'un tube conique de 15 millilitres, appuyer délicatement les bandes sur les feuilles, en prenant soin de ne pas écraser le tissu foliaire.Détachez soigneusement le ruban adhésif pour enlever l'épiderme inférieur et exposer les cellules du mésophylle. Ensuite, découpez le ruban autoclave afin qu'il s'adapte à la boîte de Pétri, et utilisez une pince pour placer le ruban dans la boîte, en le faisant flotter sur la solution enzymatique, avec les feuilles orientées vers le bas. Incubez à 60 tr/min sur un agitateur rotatif pendant 60 minutes, durant lesquelles les protoplastes seront libérés dans la solution.Après 60 minutes, utilisez des pinces pour retirer et jeter les bandes de ruban autoclave. À l’aide d’une pipette à embout large, transférez la solution contenant les protoplastes dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les protoplastes à 100 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez soigneusement le surnageant, car le culot est très lâche.Ajouter 10 millilitres de solution W5 aux protoplastes et resuspendre en agitant doucement le tube. Prélever un aliquot de protoplastes pour le dénombrement. Maintenir les protoplastes sur glace pendant 30 à 60 minutes.Pendant que les protoplastes sont sur de la glace, évaluez le rendement en comptant les protoplastes au moyen d'un hématimètre. Récupérez les protoplastes par centrifugation à 100 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Éliminez le surnageant avec précaution, car le culot est très lâche.Enfin, resuspendre les protoplastes dans la solution MMg à une concentration de 500 000 protoplastes par millilitre. Commencer la procédure de transfection des protoplastes en ajoutant dix microlitres de plasmide rapporteur dans un tube conique de 15 millilitres, suivi de 400 microlitres de protoplastes. Ajouter un volume de solution de polyéthylène glycol, ou PEG, et mélanger en retournant doucement le tube 12 fois afin de transfecter les protoplastes.Incuber de huit à quinze minutes à température ambiante. Les protoplastes doivent être incubés suffisamment longtemps pour assurer une transfection efficace, mais pas trop longtemps afin de ne pas réduire leur viabilité. Ensuite, diluer une partie du mélange ADN-PEG de protoplastes avec quatre volumes de solution W5, et mélanger en retournant doucement six fois.Recueillir les protoplastes transfectés par centrifugation à 100 g pendant deux minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette, en prenant à nouveau grand soin car le culot est très lâche. Resuspendre les protoplastes dans 1 250 microlitres de solution d’imagerie.Les protoplastes doivent se resuspendre assez facilement, ce qui indique qu'ils sont intacts après la transfection. Répartir 200 microlitres par puits dans six puits réplicats d'une plaque 96 puits, et remplir les puits vides avec la solution W5. Sceller la plaque avec un couvercle adhésif transparent approprié pour l'imagerie luminescente.Pour imager les protoplastes, transférez la plaque de 96 puits vers tout dispositif d'imagerie luminescente adapté à l'imagerie végétale. Remplacez le couvercle adhésif de la plaque 10 à 15 minutes après le transfert afin d'éviter la condensation et les différences de pression entre les puits. Commencez l'imagerie.Lisez la plaque toutes les 45 minutes pendant cinq jours à température ambiante. Ensuite, analysez les résultats de luminescence à l’aide de tout logiciel d’analyse, par exemple, le Système de logiciels d’analyse des rythmes biologiques. Les protoplastes de mésophylle isolés selon ce protocole sont présentés sur cette image avec un grossissement de 200 fois.Les protoplastes sont des arabidopsis de type sauvage et le mutant cca1/lhy a été transfecté et observé en lumière constante à l’aide d’un lecteur de plaque pendant cinq jours. Comme prévu, la période libre de l’expression génique contrôlée par l’horloge est raccourcie chez ce mutant. En revanche, la période des oscillations circadiennes dans les protoplastes du mutant ztl est allongée.Dans les protoplastes surexprimant CCA1, aucune oscillation de l'expression du construit rapporteur n'a été observée, car la surexpression de CCA1 entraîne une arythmie. Ce diagramme en barres montre les estimations de la période circadienne basées sur les courbes de luminiscence obtenues à partir des protoplastes de type sauvage et des mutants de l'horloge biologique. Ces périodes circadiennes sont conformes aux données publiées obtenues à partir de plantes entières à l'aide d'approches transgéniques longues et laborieuses.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser des plantes saines et de manipuler les protoplastes avec précaution, car ils sont fragiles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler, transfecter et imager des protoplastes d'Arabidopsis.Ces techniques peuvent désormais être appliquées à n'importe quelle lignée mutante, voire être modifiées pour imager des protoplastes d'autres espèces végétales.

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JoVE Journal

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La base moléculaire de l'espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L'isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spatiale spécifique.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Ce rapport décrit une méthode impliquant un script R dans le logiciel open source RStudio pour analyser des ensembles de données à grande échelle obtenus à partir d’expériences de séries chronologiques.

Une analyse R conviviale et puissante des ensembles de données à grande échelle

Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.

Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d&#39;âge des plantules Arabidopsis thaliana</em

Découvrez une méthode rapide d'analyse des rythmes circadiens chez Arabidopsis par imagerie luminescente de protoplastes transfectés. Cette technique évite la création de lignées transgéniques stables et accélère l'étude des mutants.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

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