Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

L’objectif global de ce test est de déterminer la période circadienne dans les raies d’Arabidopsis en mesurant la luminescence émise par les protoplastes transfectés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie circadienne, telles que les gènes qui réalimentent le mécanisme de mesure du temps lui-même. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse rapide de la période circadienne de n’importe quel mutant d’Arabidopsis sans avoir besoin de générer des lignées transgéniques stables.

Pour commencer cette procédure, étiquetez une boîte de Pétri et ajoutez-y 10 millilitres de solution enzymatique filtrée et stérilisée. Fixez quatre bandes de ruban adhésif autoclave avec le côté collant vers le haut sur une surface de laboratoire propre et marquez la taille de la boîte de Pétri sur les bandelettes. Récupérez les plans de la salle de croissance.

Coupez les feuilles de plantes de quatre semaines et appuyez sur l’épiderme supérieur sur le ruban adhésif de l’autoclave, de sorte que la surface inférieure de l’épiderme soit tournée vers le haut. Mettez des bandes de ruban adhésif magique sur la surface inférieure de l’épiderme. À l’aide d’un tube conique de 15 millilitres, appuyez doucement les bandes sur les feuilles, en prenant soin de ne pas écraser le tissu foliaire.

Retirez délicatement le ruban adhésif pour décaper l’épiderme inférieur et exposer les cellules du mésophylle. Ensuite, coupez le ruban adhésif de l’autoclave pour l’adapter à la boîte de Pétri et utilisez une pince à épiler pour déplacer le ruban dans la boîte de Pétri et faites-le flotter sur la solution enzymatique, avec les feuilles vers le bas. Faites pivoter à 60 tr/min sur une plate-forme agitée pendant 60 minutes, au cours desquelles les protoplastes seront libérés dans la solution.

Après 60 minutes, utilisez une pince à épiler pour retirer et jeter les bandes de ruban adhésif autoclave. À l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, pipetez la solution contenant les protoplastes dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les protoplastes à 100 gee pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, et retirez le surnageant avec précaution, car la pastille est très lâche.

Ajoutez 10 millilitres de solution W5 aux protoplastes et remettez en suspension en remuant doucement le tube. Prélever une aliquote de protoplastes pour le comptage. Laissez reposer les protoplastes sur de la glace pendant 30 à 60 minutes.

Pendant que les protoplastes sont sur la glace, évaluez le rendement en comptant les protoplastes dans un hémocytomètre. Recueillir les protoplastes par centrifugation à 100 gee pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant avec précaution, car la pastille est très lâche.

Enfin, remettre en suspension les protoplastes dans une solution de MMg à une concentration de 500 000 protoplastes par millilitre. Commencez la procédure de transfection des protoplastes en ajoutant dix microlitres de plasmide rapporteur dans un tube conique de 15 millilitres, suivi de 400 microlitres de protoplastes. Ajoutez un volume de polyéthylène glycol, ou solution de PEG, et mélangez en inversant doucement le tube 12 fois pour transfecter les protoplastes.

Incuber pendant huit à 15 minutes à température ambiante. Les protoplastes doivent être incubés suffisamment longtemps pour assurer une transfection efficace, mais pas trop longtemps car cela réduirait leur viabilité. Ensuite, diluez le mélange de PEG d’ADN protoplaste avec quatre volumes de solution W5 et mélangez en inversant doucement six fois.

Prélever les protoplastes transfectés par centrifugation à 100 gee pendant deux minutes à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, en faisant à nouveau très attention car la pastille est très lâche. Remettre en suspension les protoplastes dans 1 250 microlitres de solution d’imagerie.

Les protoplastes devraient se remettre en suspension assez facilement, ce qui indique qu’ils sont intacts après la transfection. Aliquote 200 microlitres par puits dans six puits répliqués d’une plaque de 96 puits, et remplissez tous les puits vides avec une solution W5. Scellez la plaque avec un couvercle transparent adhésif adapté à l’imagerie luminescente.

Pour imager les protoplastes, transférez la plaque à 96 puits dans n’importe quelle configuration d’imagerie luminescente adaptée à l’imagerie végétale. Changez le couvercle adhésif sur la plaque 10 à 15 minutes après le transfert pour éviter la condensation et les différences de pression entre les puits. Démarrez l’imagerie.

Lire la plaque toutes les 45 minutes pendant cinq jours à température ambiante. Ensuite, analysez les résultats de luminescence à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse, par exemple le système logiciel d’analyse des rythmes biologiques. Les protoplastes du mésophylle isolés par ce protocole sont représentés sur cette image à un grossissement de 200 fois.

Les proplastes sont de type sauvage, l’arabidopsis et le mutant cca1/lhy a été transfecté et imagé en lumière constante sur un lecteur de plaque pendant cinq jours. Comme prévu, la période d’expression libre des gènes contrôlée par l’horloge est raccourcie chez ce mutant. En revanche, la période des oscillations circadiennes dans les protoplastes du mutant ztl est allongée.

Dans les protoplastes surexprimant CCA1, il n’y avait pas d’oscillations dans l’expression de la construction rapporteuse car la surexpression de CCA1 conduit à l’arythmie. Ce graphique à barres montre les estimations de la période circadienne basées sur les traces de luminescence dans les protoplastes de type sauvage et les protoplastes mutants de l’horloge. Ces périodes circadiennes sont cohérentes avec les données publiées générées à partir de plantes entières à l’aide d’approches transgéniques chronophages.

Lors de cette procédure, il est important d’utiliser des plantes saines et de manipuler les protoplastes avec soin car ils sont fragiles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle fonctionne correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler, de transfecter et d’imager les protoplastes d’Arabidopsis.

Ces techniques peuvent maintenant être appliquées à n’importe quelle lignée mutante, ou même être modifiées pour imager des protoplastes d’autres espèces végétales.