Inductibles stables lignées cellulaires LAP marqués pour Enquêter la fonction des protéines, Spatiotemporal Localisation et Interaction Networks Protein

L’objectif global de cette procédure est de générer une localisation inductible et une purification d’affinité, ou des lignées cellulaires stables marquées par LAP, pour étudier la fonction des protéines, la localisation spatio-temporelle et les réseaux d’interaction protéique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie moléculaire et cellulaire liées à la fonction des protéines, au cycle cellulaire des protéines, à la localisation subzéro et aux interactions protéiques. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle se prête à l’analyse à haut débit de groupes de protéines et peut être utilisée pour disséquer les composants protéiques des voies biologiques.

Pour commencer cette procédure, clonez le cadre de lecture ouvert du gène d’intérêt dans le vecteur marqué LAP et transfectez-le dans des cellules HEK293 comme décrit dans le protocole de texte. Un jour après la transfection, remplacez le support minus Tet DMEM/F12 par un support frais. Deux jours après la transfection, divisez les cellules à 25 % de confluence.

Laissez les cellules se fixer environ cinq heures. Ensuite, ajoutez du milieu contenant de l’hygromycine moins Tet DMEM/F12 à la concentration prédéterminée. Pour les cellules HEK293, utilisez 100 microgrammes par millilitre d’hygromycine.

Remplacez le support au besoin jusqu’à ce que des foyers cellulaires distincts apparaissent qui ressemblent à des taches opaques contre la plaque transparente. Ajoutez 20 microlitres de trypsine sur chaque foyer cellulaire et faites-le monter et descendre deux fois avec une pointe de pipette de 200 microlitres. Transférez les cellules dans une plaque à 24 puits et élargissez les cellules par croissance continue dans un milieu contenant de l’hygromycine moins Tet DMEM/F12.

Élargissez la lignée cellulaire validée marquée LAP pour l’isolement de complexes protéiques par purification par affinité en tandem, ou TAP. Pour ce faire, passez continuellement toutes les cellules HEK293 dans des plaques plus grandes et/ou des flacons roulants, et moins les milieux Tet DMEM/F12 à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Pour les lignées cellulaires inductibles par Tet/Dox, induire les cellules pendant 10 à 15 heures en ajoutant une concentration de 0,2 microgramme par millilitre de Tet/Dox lorsque les cellules atteignent environ 70 % de confluence.

Récoltez les cellules par agitation ou trypsinisation. Ensuite, granulez-les à 875 fois g pendant cinq à 10 minutes. Pour coupler l’anticorps anti-GFP aux billes de protéine A, équilibrez 160 microlitres de billes de protéine A avec du PBST dans un tube de 1,5 millilitre.

Lavez les perles trois fois avec 1 millilitre de PBST. Après chaque étape de lavage tout au long de cette procédure, les billes sont centrifugées à 5000 fois g pendant 10 secondes, et le surnageant est retiré. Après avoir remis les billes en suspension dans 500 microlitres de PBST, ajoutez 80 microgrammes d’anticorps anti-GFP rapide purifié par affinité dans chaque tube, contenant 160 microlitres de billes.

Mélanger pendant une heure à température ambiante. Lavez les billes deux fois avec un millilitre de PBST, puis lavez les billes deux fois avec un millilitre de borate de sodium de 0,2 molaire, pH Après le lavage final, ajoutez 900 microlitres de tampon de borate de sodium, pour porter le volume final à un millilitre. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de DMP 220 molaires à la suspension de billes, pour une concentration finale de 20 millimolaires.

Faites tourner doucement les tubes à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation avec du DMP, laver les billes une fois avec un millilitre d’éthanolamine à 0,2 molaire, de chlorure de sodium à 0,2 molaire pH 8,5, pour inactiver l’agent de réticulation résiduel. Ensuite, mettez les billes en suspension dans un millilitre du même tampon et faites-les tourner pendant une heure à température ambiante.

Après avoir granulé les billes, mettez-les à nouveau en suspension dans 500 microlitres supplémentaires de tampon. Les billes préparées sont stables pendant plusieurs mois à quatre degrés Celsius. Pour préparer les lysats cellulaires, mettez à nouveau en suspension 500 microlitres de volume cellulaire emballé dans 2,5 millilitres de LAP 300, avec 0,5 millimolaire de DTT et des inhibiteurs de protéase.

Ajouter 90 microlitres de 10 % de phénoxypolyéthoxyléthanol de nonyle et mélanger par inversion. Placez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifuger à 21 000 fois g pendant 10 minutes.

Après la centrifugation, prélever ce surnageant à basse vitesse et réserver un échantillon de 10 microlitres pour l’analyse du gel. Après avoir transféré le surnageant à basse vitesse dans un tube TLA 100.3, tournez à 100 000 fois g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Prélever ce surnageant à grande vitesse dans un tube et le placer sur de la glace, en réservant un échantillon de 10 microlitres pour l’analyse du gel.

Pour la première capture d’affinité par liaison à des billes anti-GFP, pré-éluez les billes couplées aux anticorps en les lavant trois fois avec un millilitre de tampon d’élution pour éliminer les anticorps découplés et réduire le bruit de fond. Faites-le rapidement. Ne laissez pas les perles dans un sel élevé pendant une longue période.

Ensuite, lavez les billes trois fois avec un millilitre de LAP 200 N.Ensuite, mélangez l’extrait surnageant à grande vitesse avec des billes d’anticorps pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé l’extrait à 21 000 fois g pendant 10 minutes, réservez un échantillon de 10 microlitres du surnageant pour l’analyse du gel. Effectuez trois lavages rapides des billes avec un millilitre de LAP 200 N, contenant 0,5 millimolaire de DTT et d’inhibiteurs de protéase.

Utilisez le même tampon pour laver les billes deux fois de plus, avec un temps d’incubation de cinq minutes pour chaque lavage. Ensuite, lavez les billes rapidement deux fois de plus avec 1 millilitre de LAP 200 N contenant 0,5 millimolaire de DTT et aucun inhibiteur de protéase, avant d’ajouter la protéase du virus de la gravure du tabac, ou TEV. Ajoutez 10 microgrammes de protéase TEV dans un millilitre de LAP 200 N aux billes et faites pivoter les tubes à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, granulez les billes et transférez le surnageant dans un tube frais. Rincez les billes deux fois avec 160 microlitres de LAP 200 N, contenant 0,5 millimolaire de DTT et des inhibiteurs de protéase pour éliminer toute protéine résiduelle. Pour la deuxième capture d’affinité par liaison à l’agarose de protéine S, laver un tube de 80 microlitres de suspension d’agarose de protéine S trois fois avec un millilitre de LAP 200 N. Ajouter le surnageant élué TEV aux billes de protéine S et les secouer pendant trois heures à quatre degrés Celsius.

Après avoir granulé les billes, lavez-les trois fois avec un millilitre de LAP 200 N contenant 0,5 millimolaire de DTT et d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, lavez les perles deux fois avec un millilitre de LAP 100. Éluez les protéines de l’agarose de la protéine S en ajoutant 50 microlitres de 4 tampons d’échantillon Laemmli et en chauffant à 97 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Pour identifier les protéines en interaction par analyse par spectrométrie de masse, testez la qualité de la purification en analysant les échantillons collectés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de sodium dodécylsulfate. Colorez à l’argent le gel obtenu. De plus, immuno-épongez les éluats et sondez-les avec des anticorps anti-GFP pour vous assurer que la purification marquée au LAP a fonctionné.

Pour identifier les espèces co-épuratrices stœchiométriques et substœchiométriques, prélever l’échantillon d’élution final et le séparer par SDS-PAGE. Teindre le gel avec une coloration protéique compatible avec la spectrométrie de masse. Exciser les bandes les plus proéminentes du gel et l’espace entre elles pour traiter les bandes séparément pour l’analyse par spectrométrie de masse.

Voici une analyse par transfert Western représentative des échantillons de protéines provenant de cellules LAP-Tau HEK293 non induites et induites par Dox. Les cellules sont sondées avec des anticorps anti-tubuline pour détecter le contrôle de la charge de tubuline, et sondées avec des anti-GFP pour détecter la protéine Tau marquée LAP. Notez que LAP-Tau n’est exprimé que lorsque les cellules sont induites par Dox.

cellules mytotiques exprimant LAP-Tau ont été fixées et co-colorées pour l’ADN et la tubuline avec des anticorps anti-tubuline, et la localisation subcellulaire de LAP-Tau a été analysée par microscopie à fluorescence. Notez que LAP-Tau se localise au fuseau mitotique et aux pôles du fuseau pendant la mitose. On voit ici un gel représentatif coloré à l’argent de la purification LAP-Tau.

Les voies représentent le poids moléculaire, les lysats éliminés et les éluats finaux. Les échantillons ont été analysés sur un gel SDS-PAGE à 4-20 % et le gel a été coloré à l’argent pour visualiser les protéines purifiées. Notez qu’une bande correspondant à LAP-Tau est marquée d’un astérisque, et que plusieurs autres bandes correspondant à des protéines co-épuratrices peuvent être observées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des lignées cellulaires stables inductibles marquées au LAP et de la façon d’effectuer des purifications biochimiques de protéines marquées au LAP pour l’analyse protéomique et l’identification des réseaux d’interaction protéique.