Analyse spatiotemporelle des cytokinétique événements dans la levure de Fission

La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe est un excellent modèle pour étudier la cytocinèse, la dernière étape de la division cellulaire. Nous décrivons ici une approche de microscopie pour analyser différents événements cytokinétique dans des cellules vivantes de levure fission.

L’objectif global de cette technique de microscopie à cellules vivantes est d’étudier les événements spatio-temporels qui se produisent pendant la cytokinèse dans le système modèle de levure à fission. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cytocinétique, telles que les détails moléculaires des différents stades de la cytokinèse au fil du temps. Le principal avantage de cette technique est que différents composants spatiaux de la machinerie cytocinétique peuvent être analysés sur de longues périodes de temps avec une toxicité minimale pour les cellules.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la cytokinèse et de la levure de fission, elle peut également être appliquée à la levure bourgeonnante et à d’autres champignons. Pour commencer cette procédure, versez trois à quatre millilitres de milieu fondu mélangé à de la vitamine C dans un plat de culture à fond de verre. Une fois que le milieu s’est solidifié, utilisez un scalpel bien aiguisé pour soulever doucement la plaque de support de la boîte de culture et placez une pointe de pipette entre la plaque de support et la boîte de culture pour éviter que la plaque ne retombe dans la boîte.

Ensuite, chargez deux à cinq microlitres de culture cellulaire remise en suspension entre la plaque de milieu et le fond en verre de la boîte de culture. Retirez ensuite très délicatement l’embout de la pipette et remettez la plaque de support dans sa position d’origine sur la boîte de culture. Incuber les cellules dans la boîte de culture pendant 30 minutes à une heure dans l’obscurité à la température à laquelle la microscopie sera effectuée.

Lorsque les cellules sont prêtes pour l’imagerie, placez une goutte de wild sur le côté extérieur du verre sur la boîte de culture. Placez la boîte de culture sur un microscope inversé. Concentrez-vous sur le plan médian des cellules et assurez-vous qu’elles sont bien espacées et qu’elles ne sont pas trop encombrées.

Assurez-vous de commencer l’acquisition d’images des cellules à un stade approprié du cycle cellulaire. Dans cette expérience, il s’agit de la fin G2. Ensuite, programmez le logiciel d’acquisition d’images. Réglez le temps d’exposition pour DIC sur 100 millisecondes.

Pour les filtres GFP et RFP, utilisez des temps d’exposition de 75 millisecondes. Réglez la puissance laser à 50 %, mais notez que cela variera en fonction de l’expérience individuelle. Pour capturer des images en trois dimensions, programmez le logiciel pour acquérir la série Z.

Utilisation d’une taille de pas maximale de 4 micromètres et d’une distance de 3,0 micromètres autour du point focal central des cellules pour la capture de 16 images Z par point temporel pour une distance Z totale de 6 micromètres. Ces paramètres peuvent être modifiés en fonction de l’épaisseur de la cellule. Réglez le programme pour qu’il prenne des images toutes les deux minutes.

Sélectionnez le temps d’exposition en fonction des exigences de l’expérience. Dans cet exemple, 75 millisecondes sont utilisées. Programmez le logiciel pour qu’il arrête l’acquisition au bout de 90 minutes.

Et puis lancez l’acquisition de l’image. Le logiciel ImageJ est utilisé pour analyser l’image. Pour commencer, ouvrez la série d’images pour chacune des longueurs d’onde.

Sélectionnez une cellule à étudier. Double-cliquez sur l’option ligne de la barre d’outils pour ouvrir une autre fenêtre permettant d’ajuster la largeur de la ligne. Ajustez la largeur de la ligne pour qu’elle corresponde à la largeur de la cellule, qui est d’environ 40 à 50 pixels pour une cellule de type sauvage.

Tracez une ligne le long de l’axe long de la cellule qui vous intéresse. Cliquez sur analyser puis outils puis gestionnaire de ROI puis cliquez sur ajouter. Cela ajoutera la ligne sélectionnée à la fenêtre ROI pour une utilisation ultérieure.

Ne fermez pas cette fenêtre. Cliquez sur l’image qui vous intéresse puis sélectionnez modifier, puis sélectionner, puis redresser. Vérifiez la pile entière du processus pour redresser la cellule horizontalement.

Cliquez sur l’image, puis transformez, puis pivotez de 90 degrés vers la droite pour redresser l’image verticalement. Cliquer sur l’image puis l’empiler puis faire le montage. Cela ouvrira une fenêtre permettant d’attribuer le nombre de lignes et de colonnes pour la pile, le facteur d’échelle pour la taille de l’image, la première et la dernière tranche ou image pour le montage, et l’incrément d’image pour le montage.

Vérifiez les tranches d’étiquette et appuyez sur Entrée. Lorsqu’une fenêtre avec un montage de la cellule d’intérêt est affichée, ouvrez la série d’images pour l’autre longueur d’onde. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur l’identificateur de ligne pour sélectionner la même cellule sur le deuxième fichier image.

Répétez les étapes précédentes pour ouvrir un montage de la deuxième image. Sur l’image avec le marqueur de corps de pôle de broche, Sad1-mCherry, recherchez la séparation du marqueur de corps de pôle de broche et marquez ce point de temps comme temps zéro. Suivez le signal de la protéine annulaire Rlc1-tomate sur l’image au fil du temps, et recherchez le signal qui apparaît sous la forme d’une ligne distincte par opposition aux plaques de Rlc1-tomate.

Ce point temporel marque l’achèvement de l’assemblage du cycle d’actomyosine ou le début de la phase de maturation. Ensuite, faites défiler le film au fil du temps pour déterminer quand l’anneau de tomate Rlc1 commence à diminuer en taille. Ceci est marqué par la fin de la phase de maturation ou le début de la constriction en anneau.

Suivez le signal Rlc1-tomato au fil du temps tout au long de la constriction jusqu’à ce qu’il apparaisse comme un point au milieu de l’axe de la cellule. Ceci est marqué comme la fin de la constriction de l’anneau ou la fin de l’entrée du septum. Après le montage des images DIC, déterminer quand l’abscission est terminée.

Notez le moment où les cellules se séparent physiquement. Commencez cette analyse en sélectionnant une cellule avec un anneau d’actomyosine visible. Double-cliquez sur l’option ligne de la barre d’outils ImageJ.

Ajustez la largeur de la ligne pour qu’elle corresponde à l’épaisseur de l’anneau d’environ 15 à 20 pixels. Tracez une ligne le long de l’anneau, en prenant soin de vous assurer que toute l’épaisseur de l’anneau est incluse. Cliquez sur analyser, puis sur outils, puis sur ROI Manager, et cliquez sur ajouter.

Cela ajoutera la ligne de sélection à la fenêtre ROI pour une utilisation ultérieure. Ne fermez pas cette fenêtre. Cliquez sur l’image qui vous intéresse et sélectionnez modifier, puis sélectionner, puis redresser.

Vérifiez que le processus complète de la pile est redressé horizontalement. Réinitialisez l’intensité du plan le plus lumineux dans la pile Z redressée à l’aide de l’image, puis ajustez, puis la luminosité et le contraste, puis réinitialisez. Cliquez sur l’onglet SGK puis projet 3D pour ouvrir une boîte de dialogue.

Définissez la méthode de projection sur le point le plus lumineux et l’espacement des tranches sur deux à trois pixels. Enfin, changez l’axe de rotation en axe X ou Y en fonction de l’angle de vue souhaité. Cliquez sur interpoler et cliquez sur OK pour générer une projection 3D de l’image.

Utilisez la barre de défilement située sous l’image pour faire pivoter l’image. Ensuite, ouvrez la série d’images pour l’autre longueur d’onde. Cliquez sur l’identificateur de ligne dans le gestionnaire de retour sur investissement pour sélectionner le même anneau sur le deuxième fichier image.

Répétez les étapes précédentes pour ouvrir un anneau 3D dans l’image avec l’autre longueur d’onde. Avec les deux anneaux d’image 3D ouverts, cliquez sur l’image, puis sur la couleur, puis sur les canaux de fusion. Sélectionnez chaque image dans le menu déroulant pour la couleur correspondante souhaitée et cliquez sur OK. Comparez la localisation de différents marqueurs par rapport à la localisation au niveau de l’anneau cytocinétique ou de la membrane entrante.

Les cellules de levure de fission exprimées dans le marqueur du corps du pôle fuseau, Sad1-mCherry et le marqueur de l’anneau Rlc1-GFP ont été imagées pendant la cytokinèse. La séparation du corps du pôle de broche s’est produite à 17 minutes, désignée comme le temps zéro. Rlc1-GFP apparaît sur le site de la division quatre minutes avant la séparation du corps du pôle de broche.

Après la séparation du corps du pôle de broche, la maturation des anneaux commence à dix minutes. La constriction de l’anneau commence à 31 minutes et se termine à 53 minutes. Enfin, l’abscission cellulaire se produit 80 minutes après la séparation du corps du pôle fuseau.

La chronologie des événements cytocinétiques déterminée dans les images précédentes peut être tracée dans un graphique en référence à la mitose déterminée par la distance entre les marqueurs du corps du pôle fuseau. L’analyse du marqueur cyclique Rlc1-tomate et du marqueur de membrane du septum Bgs1-GFP au site de division tout au long de la cytokinèse révèle que l’anneau s’est assemblé avant le recrutement de Bgs1-GFP. Lorsque l’anneau se contracte, Bgs1-GFP se localise également dans la membrane d’entrée adjacente à l’anneau de constriction.

Enfin, le signal Rlc1-tomato se dissipe après la constriction en anneau tandis que Bgs1-GFP apparaît sous la forme d’un disque, restant à l’intérieur de la barrière membranaire. L’efficacité des événements cytocinétiques peut être déterminée par la distribution des protéines le long de l’anneau. Ici, la distribution de Cdc15-GFP le long de l’anneau est uniforme sur l’image de gauche, mais inégale sur l’image de droite.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de choisir des cellules avec un champ approprié, contenant idéalement six à huit cellules bien espacées à la fin de la phase G2 ou au début de la phase M, sans impuretés visibles dans la gélose. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser spatio-temporellement la localisation des protéines pendant la cytokinèse.