In Vitro Différenciation des myofibres matures pour l' imagerie en direct

L’objectif global de cette procédure est de générer des myofibres matures in vitro afin d’étudier les processus dynamiques de différenciation des myofibres à l’aide de myoblastes de souris néonatales isolés. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la médecine sur la formation de la triade de cisaillement transversale, l’assemblage du sarcomère et des myofibrilles et le positionnement des organites qui se produisent lors de la différenciation des myofibres. L’un des avantages de cette technique est que le processus de différenciation des anti et des myofibrilles peut facilement être imagé par microscopie à intervalle de temps in vitro.

Commencez par stériliser la peau d’une souris postnatale de six à huit jours avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, faites une incision dans la peau dorsale et tirez doucement la peau vers les membres postérieurs jusqu’à ce que la musculature des membres postérieurs soit complètement exposée. Retirez le tissu adipeux sans endommager les muscles.

Ensuite, pour retirer les muscles dorsaux des membres postérieurs, maintenez le membre étiré et exposez les tendons du talon. En partant des tendons, utilisez les ciseaux pour couper doucement vers le haut le long de l’os. Placer les muscles dans du PBS glacé au fur et à mesure qu’ils sont récoltés.

Ensuite, pincez les quadriceps à l’aide d’une pince à pointe fine et coupez autour du muscle sans endommager le fémur ou l’articulation du genou. Regroupement des quadriceps avec les autres échantillons de tissus. Dans un capot de culture cellulaire stérile à flux laminaire, jetez le PBS de la boîte de collecte et utilisez des ciseaux incurvés stériles pour hacher les tissus.

Lorsque tous les échantillons ont été traités, transférez les morceaux de tissu dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de mélange de digestion pour une incubation de 90 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation. À la fin de l’incubation, arrêtez la digestion avec six millilitres de milieu de dissection et granulez le tissu restant par centrifugation. L’isolement d’une suspension de cellules propres après la digestion est crucial pour le succès du protocole.

Si nécessaire, une aspiration des débris ou des centrifugations supplémentaires peuvent être effectuées pour éviter la contamination de l’échantillon. Prélever soigneusement le surnageant et centrifuger la suspension cellulaire. Remise en suspension du deuxième granulé dans cinq millilitres de milieu de dissection frais.

Ensuite, filtrez la boue à travers une crépine à cellules de 40 microns et ajoutez 25 millilitres de milieu de dissection à la suspension à cellule unique. Incuber pendant quatre heures dans un incubateur de culture cellulaire pour permettre l’adhésion des fibroblastes. Au début de la dernière heure de l’incubation, enduire deux plats de 35 millimètres par souris avec 500 microlitres de matrice à membrane basale à 1 % dans un milieu IMDM froid pendant une heure à température ambiante.

À la fin du pré-placage, récupérez le surnageant et centrifugez les cellules flottantes. Remettez en suspension les myoblastes et le milieu de croissance, et après avoir compté les cellules, ajustez le volume à la concentration cellulaire appropriée pour le placage. Ensuite, lavez les plaques recouvertes de DPBS et plaquez immédiatement les cellules pour l’incubation dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après trois jours, traitez les cellules avec les réactifs de transfection appropriés selon les instructions du fabricant et incubez les cellules avec des complexes lipidiques d’intérêt pendant cinq heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, effectuez deux lavages dans un milieu de différenciation et remettez les cellules dans l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu dans chaque plat par 200 microlitres de matrice de membrane basale à 50 % et de milieu de différenciation glacé.

Après 30 minutes supplémentaires dans l’incubateur cellulaire, complétez les cultures avec de l’agrin et du milieu de différenciation frais, en surveillant quotidiennement la différenciation et la viabilité des cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent leur pleine maturité. Pour l’immunomarquage, au point temporel expérimental d’intérêt, laver les cellules dans du DPBS suivi d’une fixation dans du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante. Après 10 minutes, lavez les cellules deux fois de plus dans du DPBS, puis perméabilisez avec 0,5 % de Triton X 100 pendant cinq minutes à température ambiante.

Après deux autres lavages DPBS, bloquez le liant non spécifique avec une solution bloquante pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, incubez les cellules avec l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans une solution bloquante pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, rincez les cellules avec trois lavages de cinq minutes dans du DPBS à température ambiante et incubez les cultures avec l’anticorps secondaire approprié à raison de 0,2 microgramme par millilitre de DAPI pendant une heure.

Après trois autres lavages DPBS, comme nous venons de le démontrer, montez les échantillons dans 200 microlitres de milieu de montage et imagez les cellules. Au deuxième jour de prolifération, les myoblastes devraient avoir adhéré à la plaque et devraient présenter la forme fusiforme typique, avec une prolifération étendue qui conduit à la formation spontanée de myotubes. Les myotubes s’allongent rapidement et présentent plusieurs noyaux alignés au centre, le nombre de myofibres matures augmentant avec le temps, affichant une épaisseur cellulaire plus élevée, des stries et des noyaux périphériques.

Les myofibres fixées au huitième jour de différenciation présentent des triades transversales confirmées par l’imagerie des composants des tubules T et du réticulum sarcoplasmique, qui sont censés colocaliser au niveau des triades. À partir du troisième jour de différenciation, les cellules présentent des contractions spontanées qui peuvent être observées couplées aux pics de calcium après la transfection du capteur de calcium. De plus, après l’imagerie, une reconstruction 3D peut être effectuée pour mieux comprendre l’organisation et la dynamique des structures complexes musculaires.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être rapide et d’éviter de garder ces cellules sensibles pendant de longues périodes en dehors d’un incubateur. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie électronique, la microscopie à super résolution, la microdissection laser ou l’oblation laser peuvent être effectuées pour une analyse plus approfondie en aval de ces cellules musculaires néonatales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les myoblastes des muscles du nouveau-né et de les cultiver pour la génération in vitro de myofibres hautement différenciées dans des conditions optimales pour l’imagerie en accéléré.