Examen des phénotypes d'accueil en affinis de Gambusia Après le traitement aux antibiotiques

Cette étude porte sur les méthodes d'effets sur un hôte modèle de poissons suivants altération des communautés microbiome composition de la peau et de l'intestin par un antibiotique révéler.

L’objectif global de ce système expérimental est d’examiner les effets secondaires négatifs sur un organisme hôte après un traitement antibiotique. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microbiome, telles que les effets secondaires associés à l’enbac sur la santé de l’hôte qui sont médiés par un microbiome perturbé. Les principaux avantages de cette technique sont donc que ce système est simple, peu coûteux pour examiner les phénotypes physiologiques des hôtes vertébrés et permet une perturbation non invasive du microbiome de la muqueuse.

Les implications de cette technique caractérisent comment une perturbation du microbiome d’un animal peut entraîner des effets secondaires majeurs. Pour commencer, appliquez une souche infectieuse d’Edwardsiella ictaluri préalablement obtenue et congelée sur une gélose moyenne sélective et différentielle d’E. Ictaluri. Incuber la culture à 27 degrés Celsius pendant deux jours.

Transférez une colonie isolée pure de la culture et inoculez une fiole de 150 millilitres contenant 40 millilitres de bouillon nutritif. Placez le flacon dans un incubateur à agitation à 27 degrés Celsius et 150 tr/min pendant deux jours. Après l’incubation, pour calibrer la culture d’E. Ictaluri en fonction des volumes de dose infectieuse souhaités, utiliser le PBST pour diluer un échantillon de la culture à une DO 650 de 0,2.

Après avoir collecté Gambusia affinis et traité les poissons avec de la rifampicine dans la colonne d’eau pendant trois jours, transférez les groupes de poissons témoins traités aux antibiotiques et non traités dans des gobelets en plastique individuels contenant 130 millilitres d’eau douce d’étang artificiel, ou APW, pendant environ 10 heures pour l’élimination du médicament des tissus de poisson. Ensuite, séparez à nouveau le poisson dans des gobelets en plastique individuels de huit onces contenant 130 millilitres d’APW propre. Administrez une dose létale de culture d’E. Ictaluri à chaque poisson et incubez le poisson à 27 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après le bain E.Ictaluri, transférez chaque poisson dans une nouvelle tasse avec 130 millilitres d’APW. Sans nourrir les poissons, enregistrez la mortalité des poissons sur la durée d’une semaine. Rassemblez les matières fécales collectées dans un sac en plastique stérile avant de les transférer dans un tube conique stérile de 15 millilitres, puis utilisez le PBST pour créer une concentration stock de matières fécales de 500 à 800 milligrammes par millilitre, à l’aide d’une pipette en plastique d’un millilitre ou plus avec la pointe coupée, préparez 130 millilitres par tasse de 15 milligrammes par millilitre ou 10 milligrammes par millilitre de matières fécales dans l’APW.

Transférez les poissons traités aux antibiotiques ou non dans des tasses individuelles de la solution, puis incubez les poissons à 25 degrés Celsius pendant deux jours, en observant de près et en enregistrant la mortalité pendant cette période. Pour traiter les poissons avec de la terre, prélevez un à quelques kilogrammes de terre végétale riche en matières organiques, d’environ sept sur 15 centimètres de profondeur, et transférez-les dans un récipient en plastique propre. Préparez des gobelets en plastique individuels contenant 18,2 grammes de terre et 130 millilitres d’APW, en mélangeant bien le sol à la main, puis transférez le poisson traité aux antibiotiques ou non dans les gobelets et laissez à 25 degrés Celsius pendant trois jours tout en enregistrant toute mortalité.

Après une période de repos de 10 heures dans l’APW après un traitement antibiotique, transférez le poisson dans des tasses individuelles contenant 17,5 milligrammes par millilitre de chlorure de sodium et d’APW, observez le poisson sur 36 heures pour la mortalité, pour effectuer un défi de toxicité du nitrate, après une période de repos de 10 heures comme auparavant, séparez le poisson dans des tasses individuelles contenant soit 10 ou 17,5 milligrammes par millilitre de nitrate de sodium et 130 millilitres d’APW. Observer les poissons pendant une journée pour détecter la mortalité à la dose élevée de nitrate de sodium, et quatre jours pour les poissons à la faible dose. Après une exposition de trois jours aux antibiotiques ou aux témoins en groupes, pour chaque poisson, remplissez des gobelets en polystyrène de huit onces avec 150 millilitres d’APW, et après avoir pesé les gobelets remplis, transférez le poisson dans les gobelets, puis enregistrez le poids corporel total pour l’évaluation initiale.

Nourrissez les poissons quotidiennement avec deux granulés de nourriture par poisson, surveillez la consommation en enregistrant visuellement les granulés non consommés. À la fin de chaque semaine pendant quatre semaines, déterminez le poids du poisson en pesant d’abord une tasse d’APW frais et notez le poids, puis versez le poisson dans une épuisette et transférez-le dans la nouvelle tasse, avant de peser à nouveau la tasse. Pour les groupes de poissons, placez 150 millilitres d’APW dans une tasse et tarez la balance.

Gardez les poissons ensemble dans les deux groupes lorsque vous les transférez dans de nouveaux contenants d’APW, puis notez le poids total du groupe. Répétez la pesée à la fin de chaque semaine au cours d’un mois. Pour analyser le temps de transit intestinal, ajoutez 360 microlitres d’eau déminéralisée stérile et 52 milligrammes de gélatine dans un tube stérile de 1,7 millilitre, et placez-le sur un bloc de chaleur à 60 degrés Celsius jusqu’à ce que la gélatine fonde et soit complètement dissoute.

À l’aide d’un mortel et d’un pilon, broyez les flocons de nourriture pour poissons rouges en une poudre fine et ajoutez 40 milligrammes de poudre dans le tube avec 20 microlitres d’huile de poisson. Après avoir mélangé, ajoutez 1,6 milligramme de dextran FitC. Versez 20 gouttes d’un microlitre de liquide chaud sur du parafilm sur la paillasse de laboratoire, et laissez-les refroidir et se solidifier rapidement.

Placez le parafilm sur la moitié d’une boîte de Pétri et faites-le flotter sur de l’eau stérile à l’intérieur d’un récipient en plastique scellé. Conservez les gouttes solidifiées au réfrigérateur jusqu’à quatre jours avant qu’elles ne deviennent trop dures pour que le poisson puisse les manger. Juste avant de nourrir, utilisez une lame de rasoir pour couper les gouttes en quarts de section.

Acclimatez les poissons à des gobelets individuels en polystyrène pendant deux jours sans les nourrir, placez les quatre quarts de la nourriture dans le gobelet à poisson et observez les poissons pendant 30 minutes pour savoir combien de morceaux de nourriture ils mangent chacun. Pour commencer la surveillance, transférez les poissons dans des tasses contenant 80 millilitres d’APW, et toutes les deux heures, prélevez un échantillon de 1 millilitre. Conservez-le dans un tube étiqueté de 1,7 millilitre à quatre degrés Celsius.

Une fois le test terminé, placez un échantillon entier d’un millilitre dans une cuvette et utilisez un spectrophotomètre de fluorescence pour enregistrer la fluorescence à une excitation de 495 nanomètres et une émission de 520 nanomètres pour tous les échantillons en même temps. comme indiqué ici, les poissons dont le microbiome est altéré par les antibiotiques étaient plus sensibles à une infection à E. Ictaluri que les poissons témoins. La différence entre le temps moyen jusqu’à la mort chez les poissons traités et les poissons témoins n’était pas significative.

Cela est probablement dû à la petite taille du groupe. Ce graphique illustre que les poissons exposés à la rifampicine étaient plus sensibles au stress osmotique que les poissons témoins, avec ce test, des niveaux de salinité supérieurs à 18 milligrammes par millilitre ont entraîné une mort rapide des poissons. Comme le montre ce tableau, lorsqu’on a été exposé à la toxine nitrate dans la colonne d’eau, la pré-exposition à un traitement antibiotique n’a pas affecté la survie.

À 10 milligrammes par millilitre, une létalité de 50 % a été observée pour le groupe traité par antibiotique et le groupe témoin à 90 heures. Dans cette expérience utilisant des poissons témoins dans un aquarium, soit deux sections d’aliments marqués au dextran FitC, soit une section a été donnée aux poissons pour examiner le temps de transit de la nourriture en mesurant la fluorescence dans l’eau environnante au fil du temps. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la mesure des réserves totales de graisse corporelle et la quantification de la production de mucus cutané peuvent être effectuées afin de comprendre les mécanismes et de réduire les facteurs de confusion qui pourraient contribuer aux effets négatifs de l’hôte.