L'ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules uniques marquées par fluorescence à partir de rétines entières vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences. Par exemple, combien de sous-types d’une classe neuronale particulière existent et quels sont les marqueurs génétiques de chaque sous-type ?

Le principal avantage de cette technique est que nous rennonçons à la nécessité de dissocier le tissu rétinien, ce qui permet aux cellules de survivre dans un environnement plus sain avant l’isolement. Les implications de cette technique s’étendent à toute population cellulaire marquée par fluorescence et peuvent donc être appliquées à d’autres systèmes pour comprendre la diversité cellulaire et la fonction dans la santé et la maladie. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car cette technique repose sur la capacité du chercheur à patch-clamper une cellule sans compromettre la viabilité de la cellule.

La démonstration future de cette méthode est essentielle car les étapes d’isolement de l’ARN peuvent être difficiles à apprendre, car la petite quantité d’ARN peut facilement se dégrader si elle n’est pas manipulée correctement et rapidement. Pour commencer cette procédure, piquez la cornée avec une aiguille et coupez-la au bord de la cornée et de la sclère. Ensuite, retirez l’objectif à l’aide d’une pince.

Faites doucement une déchirure dans la sclérotique et sectionnez le nerf optique à l’endroit où la rétine et la sclérotique se rencontrent. Terminez soigneusement l’élimination de la sclérotique de la rétine. Ensuite, retirez le vitré transparent.

Coupez les rétines en deux et conservez-les dans la solution extracellulaire oxygénée à température ambiante jusqu’à utilisation. Lorsque vous êtes prêt à monter le tissu dans la chambre d’enregistrement, transférez un morceau de rétine dans la solution enzymatique, dilué dans 500 microlitres de solution extracellulaire oxygénée dans une boîte de Pétri, et incubez-le pendant deux minutes à température ambiante sur un agitateur. Ensuite, lavez la rétine dans la solution extracellulaire oxygénée et transférez-la dans une chambre d’enregistrement à fond de verre avec une pipette de transfert en plastique.

Après cela, utilisez des pinces pour aplatir soigneusement le tissu avec la couche photoréceptrice vers le bas. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette et ancrez le tissu à l’aide d’un anneau en platine avec une maille en nylon. Ensuite, remplissez la chambre avec la solution extracellulaire oxygénée et montez-la sur une platine de microscope.

Perfuser le tissu avec la solution extracellulaire oxygénée à raison de deux à quatre millilitres par minute. Pour vous préparer à cette procédure, pulsez des micropipettes en verre pour des enregistrements électrophysiologiques à l’aide d’un extracteur de micropipettes. Observez la couche de cellules ganglionnaires à l’aide de l’optique IR-DIC.

Ensuite, identifiez la GFP et les cellules ganglionnaires à l’aide de l’épifluorescence à environ 480 nanomètres. Ensuite, localisez la pipette remplie de solution intracellulaire dans DIC. Appliquez une légère pression positive et mettez à zéro tout décalage de tension sur l’amplificateur.

Par la suite, abaissez la micropipette en verre sur une pile GFP positive et appliquez les étapes de commande de tension de test pour surveiller la résistance du joint. La pression négative doit former un joint gigaohm entre la pipette et la membrane cellulaire. Après avoir formé un joint stable, rompez la membrane en appliquant de brèves impulsions de pression négative pour accéder à l’ensemble de la cellule.

Attendez une à deux minutes que les dendrites de la cellule se remplissent de traceur fluorescent. Dans cette étape, extrayez soigneusement le contenu cytoplasmique cellulaire dans la pipette en appliquant une pression négative avec une seringue de dix millilitres. Pendant ce temps, surveillez l’extraction en DIC en visualisant la diminution de taille du corps cellulaire.

Après avoir extrait le contenu cytoplasmique, soulevez délicatement la pipette du tissu et retirez-la rapidement de la solution. Ensuite, retirez rapidement la pipette du support de la tête et rincez brièvement la pointe de la pipette avec du H2O traité au DEPC. Ensuite, connectez la pipette à une seringue d’un millilitre via le tube bien ajusté.

Expulsez immédiatement les cellules dans dix microlitres de tampon de lyse, un dans les tubes PCR de 0,2 millilitre. Centrifugez brièvement les tubes dans une mini-centrifugeuse de table à 2000 fois g pendant dix secondes. Ensuite, congelez immédiatement les échantillons sur de la glace sèche pendant cinq minutes.

Après la congélation, conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à deux semaines pour de meilleurs résultats. Pour vous préparer à cette procédure, installez un séparateur magnétique en collant la partie supérieure d’un porte-embout P20 ou P200 inversé sur le support magnétique à 96 puits. Ensuite, préparez de l’éthanol frais à 70 % à raison d’environ un millilitre par échantillon.

Retirez les billes magnétiques d’ARN d’un stockage à 4 degrés C et décongelez-les à température ambiante. Une fois que les billes d’ARN sont à température ambiante, agitez-les pendant 30 secondes pour vous assurer que la solution est bien mélangée. Après cela, décongelez les cellules à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres de H2O sans RNASE à chaque échantillon et pipetez de haut en bas. Ensuite, ajoutez 22 microlitres de billes d’ARN dans chaque tube et mélangez soigneusement. Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes pour permettre à l’ARN d’interagir et de se lier avec les billes magnétiques.

Ensuite, placez les tubes sur un séparateur magnétique pendant huit minutes. Avant de poursuivre, assurez-vous que le surnageant est dégagé. Observez les perles d’une palette et assurez-vous de ne pas la détacher du côté du tube pendant le pipetage.

Retirez le surnageant des échantillons et ajoutez 150 microlitres d’éthanol à 70 %. Ensuite, retirez l’éthanol et répétez le lavage deux fois de plus. Laissez les échantillons sécher à l’air libre pendant six minutes.

Vérifiez par intermittence si plus d’éthanol a été recueilli au fond du tube et retirez-le en conséquence. N’oubliez pas qu’il est essentiel de sécher les perles de manière appropriée. Si les billes ne sont pas assez sèches, l’éthanol peut être entraîné avec l’éluant et diminuera les rendements totaux, tandis que des billes trop séchées peuvent entraîner une perte d’ARN.

Pendant que les échantillons sèchent, préparez 10 tampons de réaction en combinant 19 microlitres de tampon de lyse, deux et un microlitre d’inhibiteur de RNASE. Faites-le tourner brièvement et gardez-le sur la glace. Une fois que les échantillons sont secs et que les billes ne semblent plus brillantes, retirez les tubes du séparateur magnétique et ajoutez 9,5 microlitres de H2O sans RNASE pour réhydrater les échantillons.

Ensuite, placez les échantillons sur de la glace et ajoutez un microlitre de tampon de réaction 10x à chaque échantillon. Cette image montre la couche de cellules ganglionnaires de la rétine, visualisée à l’aide de l’IR-DIC dans toute la préparation de la monture de la rétine. La même préparation a été visualisée en épifluorescence à environ 480 nanomètres pour identifier les cellules ganglionnaires positives à la GFP.

Cette image montre une cellule positive à la GFP qui a été ciblée pour l’enregistrement par patch-clamp et remplie d’un traceur fluorescent. L’image confocale des dendrites ipRGC imagées dans la sous-lamina activée et désactivée de la couche plexiforme interne permet de classer ces types de cellules. Les voies un à trois montrent des frottis d’ADN idéaux, tandis que les voies quatre représentent un échantillon mal traité.

La voie de contrôle doit contenir deux pics nets aux tailles de marqueur de 35 pb et 10380 pb. Voici une trace détaillée d’une bibliothèque préparée avec succès avec une intensité élevée d’environ 2 kb. Cette trace démontre également une préparation réussie, mais avec le frottis centré autour de 500 pb.

Cette image montre la sortie du bioanalyseur après le marquage, l’amplification et la purification des échantillons. La trace détaillée d’un échantillon étiqueté avec succès peut être vue ici, correspondant à l’échantillon de la première voie. Un marquage incomplet entraînera une trace telle que celle que l’on voit ici, justifiant un réétiquetage avec une nouvelle dilution.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ARN des types de cellules marquées par fluorescence dans la rétine intacte. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ARN est très sensible à la dégradation et qu’il est essentiel d’avoir des cellules rétiniennes saines. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la qPCR, l’hybridation NC2 ou l’immunohistochimie, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme si les gènes identifiés sont spécifiques à un sous-type cellulaire donné. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences, en essayant de comprendre l’hétérogénéité des neurones dans diverses régions du cerveau. La compréhension de cette hétérogénéité permettra d’étudier davantage la fonction cellulaire et la connectivité dans des populations moléculairement identifiées.