Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

L’objectif global de cette micro-injection de cellules cancéreuses du sein humain dans le poisson-zèbre embryonnaire est d’étudier le comportement invasif et d’évaluer le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du sein humain. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l’intravasation et l’extravasation aux processus critiques dans les métastases cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un modèle in vivo élégant, rapide et peu coûteux pour mesurer la capacité des cellules cancéreuses à envahir et à métastaser.

Les implications de cette technique s’étendent au développement de nouveaux composés pharmacologiques à activité anti-métastatique. Bien que cette mesure puisse donner un aperçu de l’émission du cancer et des métastases, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres phénomènes, tels que l’angiogenèse péritumorale et la dormance des cellules cancéreuses. Pour commencer, la culture a transduit des cellules MDA-MB-231 du cancer du sein humain, des cellules MCF10A épithéliales mammaires et des cellules MCF10A-Ras épithéliales mammaires dans une fiole T75.

Une fois que les cellules transduites atteignent 80 % de confluence, retirez le milieu de la fiole T75, lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate et détachez les cellules avec une solution de trypsine-EDTA à 0,5 %. Neutralisez ensuite la trypsine avec du milieu. Ensuite, centrifugez les cellules à 1 000 tr/min pendant cinq minutes pour retirer le fluide, lavez-les avec du PBS et centrifugez l’échantillon une fois de plus.

Après le lavage, remettre en suspension les cellules dans environ 200 microlitres de PBS pour obtenir une suspension ne dépassant pas 1 x 10 à la huitième cellule par millilitre. Conservez la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant cinq heures au maximum. Pour préparer les embryons de poisson-zèbre à l’implantation, incubez environ 60 embryons dans une boîte de Pétri remplie d’eau d’œuf, complétée par 60 microgrammes par millilitre de sels de mer à 28 degrés Celsius.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler fine, retirez les coriandes des embryons 48 heures après la fécondation. Pour anesthésier les embryons en vue de la procédure d’implantation, transférez-les dans une solution de tricaïne de 40 microgrammes par millilitre dans de l’eau d’œuf. Avant l’implantation, préparez les aiguilles d’injection.

Pour ce faire, chargez un tube microcapillaire en borosilicate dans un extracteur de micro-pipette et tirez l’aiguille. Rangez les aiguilles préparées dans une plaque porte-aiguille jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Aspirer 15 microlitres de la suspension cellulaire préparée dans une aiguille d’injection.

Ensuite, fixez l’aiguille à un micromanipulateur et, à l’aide d’une pince à épiler fine, cassez sa pointe à cinq à 10 microns. Ajustez la pompe pneumatique PICO et injectez les cellules dans la boîte de Pétri pré-enrobée d’agarose stérile à 1 %. Ensuite, transférez environ 10 embryons anesthésiés deux à trois jours après la fécondation sur une plaque d’injection plate recouverte de 1 % d’agarose.

Agencez la position des embryons avec un outil de boucle de cheveux de manière à ce qu’ils soient orientés dans la même direction. Pendant l’injection, ajustez manuellement la position de la plaque d’injection pour placer les embryons dans une orientation diagonale, ce qui est préférable pour une insertion précise de l’aiguille. Dirigez la pointe de l’aiguille vers le site d’injection et insérez-la doucement dans l’espace périvitellin situé entre le sac vitellin et le paraderme de l’embryon de poisson-zèbre.

Enfin, injectez environ 400 cellules tumorales marquées avec mCherry. Assurez-vous de ne pas rompre le sac vitellin pour éviter une implantation mal placée. Pour injecter les cellules dans le canal de Cuvier, approchez-vous de la veine du côté dorsal de l’embryon avec l’aiguille maintenue à un angle de 45 degrés.

Insérez l’aiguille au point de départ du canal de Cuvier, localisée dorsalement au point où le canal commence à s’élargir sur le sac vitellin. Ensuite, injectez environ 400 cellules. Enfin, transférez les embryons de poisson-zèbre injectés dans l’eau de l’œuf et incubez-les à 33 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie.

Pour visualiser les métastases, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez l’embryon de poisson-zèbre injecté dans une boîte en polystyrène à fond de verre et retirez l’excès d’eau de l’œuf. Imagez l’ensemble du corps de l’embryon à l’aide d’un microscope confocal réglé sur un faible grossissement pour obtenir un schéma général de dissémination des cellules tumorales. Utilisez un laser de 488 nanomètres pour visualiser le système vasculaire de l’embryon de poisson-zèbre et un laser de 543 nanomètres pour visualiser les cellules tumorales implantées marquées avec un marqueur fluorescent rouge.

Ensuite, scannez l’embryon en huit à 10 étapes pour obtenir une image de haute qualité. Voici des photographies d’embryons de poisson-zèbre qui ont été prises avec un microscope confocal trois jours après l’injection périvitelline de cellules MDA-MB-231. Les cellules MDA-MB-231 sont largement disséminées dans le corps du poisson-zèbre, manifestant un potentiel hautement invasif.

cellules MCF10A-Ras, lorsqu’elles ont été implantées dans des embryons de poisson-zèbre, ont révélé une capacité invasive modérée avec seulement quelques cellules propagées à des parties éloignées du corps. Lors de la transplantation, les cellules MCF10A sont restées non invasives et concentrées dans le site d’injection, confirmant que toutes les cellules étudiées révèlent un potentiel invasif différent. Le caractère hautement invasif des cellules MDA-MB-231 s’est reflété dans leur capacité de migration accrue observée dans l’espace périvitellin.

Dans une certaine mesure, une telle migration a également été observée pour les cellules MCF10A-Ras. Au contraire, les cellules MCF10A n’ont pas migré dans l’espace périvitellin. Un comportement métastatique distinct des cellules MDA-MB-231 et MCF10A-Ras a également été observé lorsque les deux types de cellules ont été implantés dans le canal embryonnaire de Cuvier.

Comme on le voit, les cellules MDA-MB-231 migrent indépendamment les unes des autres, tandis que les cellules MCF10A-Ras sont susceptibles de migrer en grappes. Suite à cette procédure, d’autres mesures telles que l’immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont les cellules cancéreuses prolifèrent chez le poisson zèbre et comment elles affectent l’hôte des cellules environnantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’utiliser le modèle de poisson-zèbre pour étudier un comportement invasif et évaluer la capacité d’intravasation et d’extravasation des cellules cancéreuses du sein humain.