Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

Bonjour, je m’appelle Immo Hansen, du laboratoire de physiologie des vecteurs moléculaires de l’Université d’État du Nouveau-Mexique. Le système de culture corporelle de graisse de moustique que nous allons démontrer aujourd’hui est un système de culture d’organes in vitro que nous utilisons dans notre laboratoire pour étudier la physiologie et le métabolisme des tissus corporels adipeux vivants attachés aux parois abdominales du corps du moustique. Le corps adipeux d’insecte est un organe dans lequel de nombreux processus métaboliques se déroulent.

Ses fonctions reflètent celles du foie et des tissus adipeux chez les vertébrés. Nous avons utilisé ce système pour étudier la régulation de la production de protéines vitellines et les mécanismes d’absorption des nutriments chez le moustique de la fièvre jaune, Aedis aegypti. Aedi aegypti est l’un des principaux vecteurs d’arbovirus comme la dengue, le chikungunya et le zika.

Le corps adipeux du moustique est la seule source de protéines jaunes chez les moustiques. Ce protocole vidéo fait la démonstration d’un système de culture corporelle de graisse de moustique in vitro et montre plusieurs applications expérimentales du système. Le protocole que nous allons démontrer est mis en place en plusieurs parties.

Tout d’abord, nous préparerons les solutions et les réactifs nécessaires au système de culture des corps adipeux. Deuxièmement, nous effectuerons des dissections de moustiques pour isoler les corps adipeux. Ensuite, la dernière chose, nous transférerons les corps adipeux isolés dans un milieu enrichi en acides aminés pour activer la synthèse des protéines du vitellin.

Il existe plusieurs applications en aval qui peuvent être effectuées après une culture de corps gras. Aujourd’hui, nous allons effectuer une culture corporelle de graisse suivie d’un séquençage de nouvelle génération. Nous comparerons deux échantillons, un échantillon non stimulé avec un échantillon stimulé par des acides aminés et de l’ecdysone.

Du matériel et de l’équipement supplémentaires seront nécessaires, notamment un aspirateur avec flacon de collecte des moustiques, un tampon anti-mouches CO2 relié à une bouteille de gaz CO2, de l’éthanol pour nettoyer le tampon anti-mouches, un microscope stéréoscopique avec source lumineuse, des micro-ciseaux de dissection, une pince à épiler à pointe fine et des plaques à 96 puits. Pour se préparer à la culture de corps adipeux, trois solutions mères et réactifs doivent être préparés, la solution mère aminologique, la solution mère saline physiologique Aedes et la solution mère de calcium. La solution mère physiologique saline d’Aedes et la solution mère de calcium sont combinées pour former le milieu de culture du corps adipeux.

Les moustiques utilisés pour cette expérience doivent être âgés d’au moins trois jours après l’émergence. À l’aide d’un aspirateur alimenté par piles, recueillez les moustiques dans un flacon de collecte. Placez le flacon de prélèvement avec votre échantillon sur un tampon de CO2 pour anesthésier les moustiques.

Alternativement, la glace peut être utilisée pour anesthésier les moustiques. Jetez tous les mâles avant de commencer les dissections. Concentrez d’abord le microscope de dissection à l’aide d’un moustique de test pour assurer la visibilité.

Une fois que vous avez mis le microscope au point, placez une lame concave sur le microscope et placez deux gouttes d’APS au centre. L’APS aide à maintenir le moustique élevé et à collecter divers organes du moustique. Sélectionnez le moustique avec la pince, en ramassant le moustique par les pattes.

Retirez les pattes. Tout en tenant le moustique par le thorax avec votre main gauche, utilisez l’autre pince pour saisir le moustique par les deux ou trois derniers segments de l’abdomen et tirez doucement pour l’enlever. Cette action devrait éliminer les ovaires, les tubules de Malpighian, l’intestin postérieur, l’intestin moyen et le jabot.

Une fois les organes retirés, utilisez les ciseaux à ressort pour terminer la dissection du corps adipeux. Insérez une lame dans le trou qui a été créé en enlevant les deux ou trois derniers segments de l’abdomen et coupez l’abdomen dans le sens de la longueur jusqu’à ce qu’il atteigne le segment sous le thorax. Après l’incision, l’abdomen doit se dilater vers l’extérieur.

Une autre incision est pratiquée latéralement sur le haut de l’abdomen où votre première incision s’est terminée. Après les incisions, l’abdomen s’ouvre et flotte avec la cuticule vers le haut et les corps adipeux reposant dans l’APS. Une fois que les corps adipeux se sont équilibrés sur la solution APS pendant au moins une demi-heure, ils peuvent ensuite être transférés dans le milieu de culture des corps adipeux.

Afin de stimuler les corps adipeux pour commencer l’expression du gène de la protéine jaune, nous les transférons dans un milieu avec des niveaux élevés d’acides aminés libres et l’hormone stéroïde d’insecte, la 20-hydroxyecdysone. Une fois transférés, les corps adipeux sont incubés pendant six heures dans le milieu. Après la période d’incubation, les corps graisseux sont transférés dans un tube Eppendorf avec un tampon approprié pour les analyses souhaitées.

En fonction de l’objectif de l’expérience, les corps adipeux peuvent être utilisés dans plusieurs protocoles ultérieurs tels que la qPCR, les Western blots, la protéomique, la métabolomique ou le RNA-seq. À titre d’exemple, nous avons réalisé une expérience de culture de corps gras et stimulé des corps adipeux isolés en les incubant sur une solution contenant un mélange équilibré des 20 acides aminés naturels et de l’hormone stéroïde d’insecte 20-hydroxyecdysone pendant six heures alors que les corps adipeux témoins ont été incubés sur un PS pendant une durée égale. Cette figure montre les résultats d’une analyse RNA-seq de notre expérience.

La carte thermique indique les niveaux d’expression génique de 1256 gènes exprimés dans des corps adipeux cultivés sous deux traitements différents. Tous ces gènes ont considérablement modifié les niveaux d’expression entre les deux traitements. Ce tableau montre les dix gènes les plus régulés à la hausse après l’activation de corps adipeux cultivés avec des acides aminés et de la 20-hydroxyecdysone.

Comme prévu, la plupart de ces gènes sont des gènes de protéines vitellines. Merci de votre intérêt pour la culture corporelle de la graisse des moustiques.