In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1^gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’utiliser la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral et l’ophtalmoscopie laser à balayage pour obtenir des informations sur l’épaisseur de la rétine et la distribution des cellules microgliales, respectivement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie expérimentale sur la corrélation entre les anomalies rétiniennes et l’accumulation de cellules microgliales. Les principaux avantages de cette technique sont que ces informations peuvent être obtenues en temps réel de manière non invasive.

Après avoir confirmé l’absence de réponse à l’écouvillonnage de la cornée, placez la souris en position couchée sur le côté gauche de la plate-forme, avec l’orbite droite face à la lentille. Appliquez une goutte d’hydroxypropylméthylcellulose dans une lentille de contact rigide et perméable aux gaz de plus quatre dioptries sur l’œil droit et démarrez le module d’acquisition. Pour les balayages B, sélectionnez l’option Tomographie infrarouge et par cohérence optique Sous Application et structure, sélectionnez Rétine et utilisez le micromanipulateur pour déplacer la lentille vers l’œil de la souris.

Avant de faire la mise au point sur la rétine, vérifiez que l’indicateur Oculus Dexter est sélectionné, puis utilisez le bouton de mise au point pour zoomer sur la rétine jusqu’à ce que les gros vaisseaux soient clairement visibles sur l’image du fond d’œil sur le côté gauche de l’écran du moniteur. Utilisez le micro-manipulateur pour ajuster la position de la caméra, si nécessaire, en tournant le bouton de sensibilité pour réduire ou augmenter la luminosité de l’image du fond d’œil, le cas échéant. Sélectionnez le balayage linéaire dans le menu Motif et utilisez le micromanipulateur pour déplacer le balayage B entre les coins supérieur et inférieur de la fenêtre de balayage de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral, ou SD-OCT.

Réglez la valeur en temps réel automatique sur au moins neuf pour obtenir une qualité d’image élevée, puis cliquez sur Acquérir. Lorsque toutes les images ont été obtenues, transférez la lentille de contact de l’œil dans une solution saline fraîchement équilibrée et hydratez la cornée avec une goutte fraîche d’hydroxypropylméthylcellulose. Une fois l’œil gauche imagé, tournez l’optique standard de 30 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour la retirer et montez l’objectif de 55 degrés pour une deuxième série d’imagerie.

Pour évaluer l’autofluorescence, sans bouger la souris, sélectionnez Infrarouge sur le panneau de commande et concentrez-vous sur les gros vaisseaux rétiniens. Sélectionnez l’imagerie par fluorescence automatique et utilisez le bouton de sensibilité pour régler la luminosité de l’image, si nécessaire. Appuyez une fois sur le bouton de sensibilité et réglez la valeur automatique en temps réel sur au moins 67.

Lorsque la valeur automatique en temps réel a été atteinte, acquérez l’image et appuyez une seconde fois sur le bouton de sensibilité pour arrêter le calcul de la moyenne. Ajustez la mise au point pour visualiser les différentes couches rétiniennes, selon les expériences appropriées. Lorsque toutes les images ont été obtenues, passez à l’objectif à grand champ de 102 degrés sur l’optique et imagez l’autofluorescence dans chaque œil, comme nous venons de le démontrer.

Pour mesurer manuellement l’épaisseur de la rétine dans chaque image, double-cliquez sur le nom du premier animal de laboratoire pour ouvrir le balayage OCT. Ouvrez un balayage B obtenu avec l’objectif à 30 ou 55 degrés et sélectionnez le profil d’épaisseur. Cliquez sur l’icône Modifier les segmentations de couche.

Le logiciel identifiera automatiquement les membranes de limitation et de base internes. Pour corriger manuellement la position des membranes, sélectionnez le calque à modifier, ainsi que l’option cercle rouge. En maintenant le bouton de la souris enfoncé, déplacez le cercle pour modifier la ligne jusqu’à ce que le calque correspondant soit correctement positionné et cliquez sur Enregistrer et fermer pour quitter la fenêtre.

Sous l’option Calque, sélectionnez Rétine et cliquez sur une autre position sur le diagramme pour afficher l’épaisseur de la rétine pour la position sélectionnée. Mesurez ensuite l’épaisseur de la rétine et la distance souhaitée par rapport à la tête du nerf optique et exportez les valeurs dans une feuille de calcul. Dans ces balayages uniques SD-OCT représentatifs d’une souris homozygote pour l’expression de gfp sous le promoteur Cx3cr1, l’architecture rétinienne est clairement visualisée dans les images de lentille à 30 degrés et à 55 degrés.

Cependant, une réflectivité élevée de la choroïde est observée dans les balayages obtenus avec la lentille à 30 degrés. Après le SD-OCT, l’ophtalmoscopie laser à balayage permet de visualiser les cellules microgliales individuelles gfp positives dans la rétine à l’aide d’une lentille à 55 degrés ou à 102 degrés avec une couverture de la zone du fond d’œil plus grande obtenue avec la lentille à 102 degrés. Dans les scans SD-OCT, après correction manuelle des limites rétiniennes de limitation interne et de la membrane de base, une bonne corrélation de la mesure de l’épaisseur rétinienne est généralement observée entre les verres à 30 et 55 degrés lorsque la même distance de la tête du nerf optique est mesurée.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinquante minutes si elle est exécutée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ophtalmologie expérimentale pour explorer la pathologie rétinienne chez les petits rongeurs in vivo.