Évaluation de Dictyostelium discoideum réponse à la Stimulation mécanique aiguë

L’objectif général de cette procédure est d’examiner l’activité de divers composants du réseau de transduction du signal intracellulaire à la suite d’une brève perturbation mécanique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que la façon dont les cellules détectent et migrent vers divers signaux environnementaux, y compris les stimuli mécaniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’examiner la réponse initiale à un stimulus mécanique sans la contribution confondante de la motilité ou de la polarité à la réponse.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons testé la réponse des cellules adhérentes au chimioattractant qui était délivré avec une légère agitation et nous avons remarqué une réponse robuste des cellules stimulées par le contrôle du véhicule. Pour commencer, préparez Klebsiella aerogenes en inoculant un petit nombre de cellules de stock congelé dans un milieu HL5 sans antibiotiques et incubez la culture pendant la nuit. La croissance de Dictyostelium en présence de bactéries Klebsiella aerogenes réduira le nombre de macropinosomes, ce qui améliorera la réponse cellulaire aux stimuli externes.

Chronométrez l’expérience de sorte que lorsque les bactéries sont prêtes, il y a du Dictyostelium qui croît de façon exponentielle. Prélevez ces cellules de Dictyostelium et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, étalez 260 microlitres de la suspension bactérienne contenant 100 000 cellules de Dictyostelium sur une plaque SM.

Également pour l’assurance, préparez des plaques avec deux fois plus et deux fois moins de cellules Dictyostelium. Après une journée de croissance à température ambiante, inversez la plaque et continuez la culture de la plaque jusqu’à ce que les cellules Dictyostelium commencent à nettoyer la pelouse bactérienne mais n’ont pas encore commencé à s’agréger. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon DB dans la plaque et grattez le Dictyostelium à l’aide d’un épandeur de verre.

Transférez les cellules et la solution dans un tube en polypropylène de 50 millilitres, puis rincez la plaque avec cinq autres millilitres de DB et ajoutez-le également dans le tube de 50 millilitres. Répétez l’opération si nécessaire. Pour laver le Dictyostelium, remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres de DB, granulez les cellules, puis aspirez et jetez le surnageant.

Lavez les cellules à plusieurs reprises jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Enfin, réintroduisez le Dictyostelium dans le tampon DB à environ cinq millions de cellules par millilitre. Pour commencer, déposez deux millions de Dictyostelium compétents en agrégation sur des plats de 35 millimètres avec deux millilitres de DB. Préparez une assiette pour chaque point temporel et un témoin non stimulé.

À température ambiante, laissez les cellules se fixer à la plaque pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules non attachées de la plaque à l’aide de deux rinçages avec un millilitre de DB. Une fois que les plaques sont débarrassées du dictyostelium non attaché, incubez les cellules attachées dans un tampon de basolation pendant 30 minutes sans déranger les plaques. Il est très important d’éviter tout mouvement des plaques pendant l’incubation d’une demi-heure pour éviter une stimulation prématurée des cellules.

Maintenant, pour appliquer une quantité contrôlée de stimulation mécanique, transférez individuellement une plaque dans un agitateur orbital et faites fonctionner l’agitateur à 150 tr/min pendant cinq secondes. Ensuite, après le temps souhaité, aspirez le tampon et placez rapidement la plaque sur de la glace. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase et grattez les cellules.

Recueillez le lysat dans des tubes de 1,5 millilitre et chauffez-les rapidement à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Procédez à l’analyse du lysat ou transférez-le à moins 20 degrés Celsius pour le stockage. Après avoir mis en suspension des cellules végétatives ou compétentes en agrégation, chargez environ 600 microlitres dans la lame de la chambre microfluidique.

Les entrées doivent être complètement remplies, alors complétez-les avec un tampon si nécessaire. Laissez les cellules se fixer pendant 10 minutes. Connectez une ligne d’entrée pour l’appareil à une pompe électronique avec un réservoir de 15 millilitres.

À l’aide du contrôle logiciel de la pompe, fermez la vanne, puis remplissez le réservoir avec DB. Maintenant, réglez la pression sur 50 millibars et allumez la pompe. Remplissez et rincez la conduite avec DB en cliquant sur la vanne pour l’ouvrir. Après avoir rincé pendant environ 30 secondes, remettez la pression à zéro, puis fermez la vanne.

Ensuite, connectez la ligne à l’une des trois entrées d’un côté de la glissière. Ne piégez pas de bulles d’air et une fois la connexion établie, couvrez les deux autres entrées de ce côté de la glissière. Maintenant, terminez la configuration en connectant la conduite du drain à la sortie unique du côté opposé de la glissière.

Ensuite, sous un éclairage en fond clair ou en phase sur un microscope fluorescent, visualisez le canal avec un objectif à air 20X et rincez le canal. Ensuite, réglez la pression à environ 50 millibars et ouvrez la vanne. Une fois que le liquide sort du drain, réduisez la pression externe à zéro, attendez environ 30 secondes et fermez la vanne.

Ensuite, passez à l’objectif à huile 40X, concentrez-vous sur la partie la plus large du canal et préparez le logiciel à collecter des images toutes les trois secondes avec un éclairage RFP ou GFP. Avec la vanne fermée, réglez la pression sur la valeur souhaitée. Ensuite, acquérez cinq images de pré-stimulation à trois secondes d’intervalle.

Ensuite, ouvrez brièvement la valve pour délivrer le stimulus. Maintenant, collectez au moins 15 images de données supplémentaires sur 45 secondes. Quantifiez la réponse telle que décrite dans le protocole textuel.

Tout d’abord, chargez une lame microfluidique avec du Dictyostelium comme décrit dans la section précédente. Pour cette expérience, préparez deux lignes d’entrée. Pour fermer les lignes, utilisez une pince physique sur la ligne transportant la solution de traitement et la vanne commandée par logiciel pour fermer la ligne transportant la solution DB avec le véhicule.

Maintenant, remplissez les deux lignes avec la solution appropriée, tampon plus véhicule seul ou tampon avec le traitement tel qu’un inhibiteur. Une fois les conduites rincées, connectez-les à deux entrées sur le côté de la glissière avec le canal et bouchez l’entrée inutilisée. Ensuite, connectez la conduite de vidange à la sortie du côté opposé.

Maintenant, lavez la diapositive à l’aide du tampon plus le véhicule comme décrit précédemment. Ensuite, remplissez le canal avec le traitement. Tout d’abord, réduisez le débit à zéro millibar.

Ensuite, changez les vannes, faites couler le traitement pendant environ 15 secondes et commencez à chronométrer l’incubation. Toutes les 10 minutes environ, versez une nouvelle solution de traitement sur les cellules pendant environ 15 secondes pour reconstituer les niveaux d’oxygène dans la chambre. Les cellules adhérentes compétentes en agrégation ont été exposées à cinq secondes d’écoulement de cisaillement à l’aide d’un agitateur orbital.

Les Dictyostelium ont été prétraités avec de la caféine pour réduire leur activité basale. En conséquence, il y avait une très faible activité basale de PKBR1 et ERK2 et une augmentation robuste de la phosphorylation des résidus clés de ces kinases avec la stimulation. Dans les cellules compétentes en agrégation exprimant divers biocapteurs marqués par fluorescence, deux marqueurs de bord d’attaque, PHcrac et LimE, qui sont recrutés par PIP3 ou l’actine nouvellement polymérisée, ont tous deux montré une localisation principalement cytosolique dans les cellules au repos.

Après cinq secondes de flux de cisaillement, ces biocapteurs se sont rapidement relocalisés dans le cortex et sont retournés au cytosol. Les effets de la latrunculine A, un médicament dépolymérisant l’actine, ont été testés à l’aide d’une expérience similaire sur la force de cisaillement. Dans ce cas, les cellules végétatives ont d’abord été exposées à des conditions de contrôle, puis passées au tampon contenant l’agent d’essai souhaité.

Le traitement à la latronculine A a bloqué la relocalisation des marqueurs de bord d’attaque dans le cortex. Curieusement, si le flux n’a pas été interrompu après deux secondes mais est resté allumé pendant toute la durée de l’expérience, une réponse globale transitoire a tout de même été observée. Suite à la réponse globale, les cellules végétatives ont migré à contre-courant.

Une bonne préparation des cellules est extrêmement importante pour le succès de ces tests. Les cellules végétatives doivent être cultivées en association avec des bactéries pour assurer leur réactivité à la stimulation mécanique. Pour les cellules compétentes en agrégation, les cellules qui sont sous-développées ou surdéveloppées ont tendance à mal répondre.

Les approches biochimiques et microscopiques se complètent, ce qui nous a permis d’évaluer un grand nombre d’intermédiaires de transduction du signal pour leur réponse à la stimulation mécanique. En ajoutant des perturbations pharmacologiques et génétiques, nous pouvons apprendre comment les stimuli mécaniques sont perçus et transmis. Ceci est important pour comprendre la migration cellulaire dirigée qui est guidée par des stimuli physiques tels que le flux de cisaillement.

Étant donné que la stimulation mécanique déclenche l’activation du même réseau de transduction de signal que les chimioattractants, nous pouvons maintenant examiner l’intégration de divers stimuli sur les cellules. En fin de compte, ces études nous aideront à comprendre comment les cellules migratrices telles que nos propres cellules immunitaires et les cellules cancéreuses métastatiques naviguent dans le corps.