Name: Évaluation de Dictyostelium discoideum réponse à la Stimulation mécanique aiguë (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation des réponses cellulaires à la stimulation mécanique aiguë chez Dictyostelium discoideum. Cette technique permet d'étudier la mécanotransduction sans interférence de la motilité cellulaire.

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<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
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<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici offrent un moyen pratique d’évaluer tant la population que les comportement de cellules individuelles en réponse flux de cisaillement. Ce qui est important, alors que des études antérieures analysé localisation de capacitive et inductive des balises de bord pendant la migration, l’approche actuelle permet les effets immédiats en appliquant le flux de cisaillement aiguë. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que, en fait, la réponse initiale de cellules aux flux de cisaillement n’exige ...

Migration des cellules eucaryotes est biaisée par divers indices physiques et chimiques dans l’environnement, y compris les gradients des chimioattractants soluble ou substrat-bondissent, rigidité variable des substrats, des champs électriques ou un écoulement cisaillé. Bien qu’il y a eu de nombreux progrès dans notre compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à la chimiotaxie, moins est connu sur les autres types de migration dirigée et comment ces divers signaux est intégrés au niveau cellulaire pour produire un unifié migrateurs réponse.
Réalisé la migration vers une concentration accrue d’un facteur chimiotactique comporte trois composantes comportementales : mobilité, détection directionnelle et polarité1. Motilité fait référence au mouvement aléatoire des cellules en saillie de pseudopodes. Directionnel de détection est la capacité d’une cellule à détecter la source d’un facteur chimiotactique, qui peut se produire même en immobilisé les cellules. Polarité se réfère à la distribution asymétrique plus stable des composants intracellulaires entre le leader et le bord en retard d’une cellule, ce qui conduit à une persistance accrue en mouvement.
Réponse cellulaire à un facteur chimiotactique dépend de l’activité de quatre réseaux de régulation définis sur le plan conceptuel : récepteur / G protéines, transduction du signal, le cytosquelette d’actine et polarité1. Chemoattractant liaison à des récepteurs couplés aux protéines G transmet le signal via heterotrimeric G protéines α et βγ au réseau de transduction du signal en aval, qui amplifie le signal directionnel. Des voies multiples au sein du réseau de transduction de signal en parallèle et alimentent le réseau de cytosquelette d’actine à la polymérisation de l’actine biais et saillie de pseudopodes qui en résulte, dans le sens du dégradé. Parmi les importants régulateurs de la chimiotaxie sont Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), phosphatase et tensine homologue (PTEN) et guanylyl cyclase. Mécanismes de rétroaction au sein du réseau de transduction de signal, ainsi qu’entre la transduction du signal et réseaux de l’actine cytosquelette encore amplifient la réponse. Enfin, le réseau de polarité mal définis reçoit l’entrée du cytosquelette d’actine et biaise davantage le réseau de transduction de signal pour promouvoir la migration persistante dans le sens du dégradé.
Une grande partie de notre interprétation mécaniste de la chimiotaxie a été rendue possible en raison du développement de biocapteurs fluorescent-étiquetées pour divers éléments des réseaux de régulation. Beaucoup de régulateurs de chimiotactisme ont une répartition asymétrique de la molécule de réglementation elle-même ou son activité. Par exemple, biocapteurs qui reconnaissent activé versions de petites GTPases Ras et Rap1 – domaines de liaison du Ras de Raf1 (dénommé RBD ici) et RalGDS, respectivement – localiser à la fine pointe de la cellule chemotaxing2,3. De même, PI3K et son produit phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), reconnu par un domaine d’homologie (PH) pleckstrine, montrent également la localisation à l’avant d’une cellule4,5. En revanche, un gène PTEN 3-phosphatase, qui reconvertit PIP3 phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, se localise au bord de la cellule6en retard de développement. Ce qui est important, ces biocapteurs changent leur localisation en réponse à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique. Marqueurs pointe qui sont cytosoliques ou sur les conseils de saillies dans une cellule au repos, relocaliser au cortex, tandis que les balises de bord, qui ont une localisation corticale et sont absents à la traîne depuis le bout des protubérances dans une cellule au repos, devenir cytosolique après stimulation. Analyse de la distribution de biocapteur en réponse à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique minimise la contribution de la motilité et de la polarité, qui confond souvent les observations. La stimulation globale ou uniforme d’une suspension de cellules avec un facteur chimiotactique est également utilisée comme un outil pour évaluer l’évolution de l’ensemble de la population dans l’activation de la protéine, souvent détecté par phosphorylation de protéines,7,8,9 . Ce dosage biochimique est principalement utilisé pour obtenir des informations temporelles, alors que la microscopie sert à recueillir des informations spatiales et temporelles sur le comportement des diverses composantes des réseaux réglementaires.
Le réseau de transduction de signal comporte un système excitables10,11. Réponses aux stimuli chimiotactiques supraliminaire sont « tout ou rien » et affichent les périodes réfractaires. Les réponses sont également déclenchés de manière stochastique et peuvent montrer des comportement oscillatoire. Événements de transduction de signal sont localisées aux régions du cortex qui se propagent en ondes12,13,14,15. Avant, arrière, marqueurs sont recrutés à ou dissocient, les zones actives des propagation des ondes. En raison de la région réfractaire à la zone active, les vagues opposées dirigés anéantissement qu’ils se rencontrent. Les propagation des ondes de transduction du signal sous-tendent les protubérances cellulaires qui assurent la médiation cell migration10.
Une grande partie de l’information susmentionnée sur la chimiotaxie est venu des études sur l’amibe sociale Dictyostelium discoideum, bien que les mécanismes de réglementation semblables sont appliquent également aux neutrophiles et autres types de cellules de mammifères16 . Dictyostelium est un organisme modèle bien établi qui a une réponse chimiotactique robuste durant le jeûne, quand des milliers de cellules individuelles migrent vers un centre de regroupement, finissent par former une fructification multicellulaire contenant des spores. La chimiotaxie est également essentielle durant la phase de croissance de cellule unique de cet organisme pour localiser les sources de nourriture bactérienne. Ce qui est important, la migration des cellules individuelles de Dictyostelium est remarquablement similaire à la migration des neutrophiles chez les mammifères ou les cellules de cancer métastatique, qui subissent une très rapide de type amiboïdes migration. En fait, les deux la topologie globale des réseaux de régulation, ainsi que de nombreux des voies de transduction de signaux individuels impliqués dans la chimiotaxie sont conservées entre Dictyostelium et leucocytes mammifères17. Par ailleurs, les autres cellules, comme les fibroblastes, utilisent des récepteurs tyrosine kinase (RTK) au lieu de RCPG ; Cependant, RTK peut alimenter des réseaux similaires.
Contrairement à la chimiotaxie, manque de compréhension approfondie des mécanismes de signalisation qui animent les divers autres modes de migration dirigée. De la même façon aux cellules migrant dans un gradient chimiotactique plusieurs études ont rapporté l’activation et/ou la localisation des marqueurs typiques de pointe, y compris la polymérisation de l’actine, PIP3 et/ou kinase de signal-réglée extracellulaire (ERK) 1/2, à la face avant des cellules subissant dirigée migration en réponse à cisaillement des flux ou des changements dans les champs électriques18,19,20,21. Toutefois, dans ces études une exposition continue au stimulus a aussi entraîné la migration cellulaire, laissant ouverte la question si, par exemple, les marqueurs pointe localiser spécifiquement en réponse à un stimulus, ou si elles Localisez simplement à la fine pointe en raison de l’augmentation du nombre des pseudopodes à l’avant d’une cellule de migration.
Nous avons développé des analyses qui nous permettent d’observer la réaction des cellules à des perturbations mécaniques Aigues livrée comme un écoulement cisaillé tant au niveau des populations et des cellules individuelles,22. Semblable à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique, stimula aiguëtion avec le flux de cisaillement permet l’étude d’une réponse cellulaire à un stimulus mécanique sans la contribution confondant de motilité ou polarité. Combinant ces tests biochimiques et microscopiques avec des perturbations génétiques ou pharmacologiques nous permet d’apprendre sur des stimuli mécaniques comment sont perçus et transmis. En outre, cette approche fournit également une méthode originale pour puiser dans le système en aval du récepteur facteur chimiotactique en l’absence d’un facteur chimiotactique, isolant ainsi les réseaux signal transduction et l’actine cytosquelette du récepteur/G réseau de protéine.
À l’aide des techniques décrites ci-dessous, nous a récemment démontré que cette contrainte de cisaillement aiguë conduit à l’activation de plusieurs composants du signal chimiotactique transduction et l’actine cytosquelette réseaux22. En appliquant le stimulus mécanique aiguë à Vendranges, nous avons démontré que, de même pour chimioattractants, réponse aux stimuli mécaniques aussi pièces dispose d’un système nerveux, y compris le comportement de tout ou rien de la réponse sous conditions de saturation et la présence d’une période réfractaire. Enfin, en combinant la stimulation mécanique et chimique, nous avons montré que les deux stimuli partagent signal transduction et l’actine cytosquelette réseaux, permettant probablement pour l’intégration de multiples stimuli à la migration cellulaire biais.

<table><tbody><tr><td><réactifs fort>s</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextrose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>À utiliser pour préparer les milieux HL-5 et les plaques SM (étapes 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Peptone protéose</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td> À <td>utiliser pour préparer les milieux HL-5 (étape 1.1)</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>À utiliser pour préparer les milieux HL-5 et les plaques SM (étapes 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot ; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td> À <td>utiliser pour préparer les milieux HL-5 et le tampon phosphate 10X (étapes 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>À utiliser pour préparer les milieux HL-5, les plaques SM et le tampon phosphate 10X (étapes 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Streptomycine (sulfate de dihydrostreptomycine)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Utiliser pour préparer les milieux HL-5 (étape 1.1)</td></tr><tr><td>Peptone (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0 À</td><td>utiliser pour préparer les plaques SM (étape 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>À utiliser pour préparer les plaques SM (étape 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>À utiliser pour préparer les plaques SM (étape 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>À utiliser pour préparer le tampon DB (étape 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>À utiliser pour préparer le tampon DB (étape 1.4)</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td> À <td>utiliser pour préparer la caféine (étape 1.5)</td></tr><tr><td>AMPc (EMD Millipore Calbiochem Adénosine 3 pi.,5 pi.-monophosphate cyclique, sel de sodium)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>À utiliser pour préparer l’AMPc (étape 1.6)</td></tr><tr><td>Acide folique</td><td>Sigma</td><td>F7876</td> À <td>utiliser pour préparer le colorant folique acide (étape 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Utilisation pour préparer le tampon d’échantillon 3X (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Utilisation pour préparer le tampon d’échantillon 3X (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Utilisation pour préparer le tampon d’échantillon 3X (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Utilisation pour préparer le tampon d’échantillon 3X (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Utiliser pour préparer le tampon d’échantillon 3X (étape 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Utiliser pour préparer le tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Utiliser pour préparer un tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Pyrophosphate de sodium décahydraté</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>À utiliser pour préparer un tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>À utiliser pour préparer un tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (étape 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>À utiliser pour préparer la latrunculine A (étape 1.9)</td></tr><tr><td>Gel de polyacrylamide Tris-HCl à 4-15 %</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Utilisation pour l’immunobuvardage (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Membrane de fluorure de polyvinylidène</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Utilisation pour l’immunobuvardage (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticorps de lapin</td> Signalisation cellulaire <td>2060</td><td>Anticorps primaire pour utilisation dans l’immunobuvard (étape 3.3)</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticorps XP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4370</td><td>Anticorps primaire pour utilisation dans l’immunoblot (étape 3.3)</td></tr><tr><td>IgG de lapin HRP Linked Whole Ab (de l’âne)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Anticorps secondaire pour utilisation dans l’immunoblot (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Substrat de chimiluminescence améliorée (substrat Clarity Western ECL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Utilisation pour l’immunoblot (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Tampon d’extraction (Restore Plus Western blot Tampon d’extraction)</td><td>Percer</td><td>PI46430</td><td>Utilisation pour l’immunobuvardage (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Utilisation pour l’immunotransfert (étape 3.3)</td></tr><tr><td>Souche K. aerogenes (non pathogène)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrateur orbital (modèle G-33, ou une alternative comparable)</td><td>Nouveau-Brunswick Scientifique</td><td></td><td>Utilisation pour cultiver K. aerogenes (étape 2.1.1), et pour basaler et stimuler les cellules D. discoideum (étape 3). Le rayon de giration de ce shaker est de 9,5 mm.</td></tr><tr>Boîte de Pétri <td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>de 10 cm</td><td>Utiliser pour préparer les plaques SM (étape 1.2)</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Utiliser pour compter les cellules D. discoideum (étape 2.1.2)</td></tr><tr><td>Boîte de 35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Utiliser pour plaquer les cellules D. discoideumcells pour une stimulation mécanique suivie d’une lyse cellulaire (étape 3.1.1)</td></tr><tr><td>Gobelet en polystyrène (5 mL)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td> À <td>utiliser pour stimuler la suspension de cellules D. discoideum avec un chimioattracteur (étape 3.2.2)</td></tr><tr><td>Unité fluidique avec pompe (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td> À <td>utiliser pour fournir une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum dans un canal (étapes 4.1, 4.2 et 5)</td></tr><tr><td>Lame avec un canal (&mu ;-Slide III 3in1 ibiTreat : lamelle en polymère #1.5, traitée pour culture tissulaire, stérilisée)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>À utiliser pour plaquer des cellules D. discoideum pour une stimulation mécanique délivrée par un dispositif fluidique (étapes 4.1, 4.2 et 5)</td></tr><tr><td>Réservoirs de 50 mL (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Permet de configurer le dispositif fluidique pour administrer une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum dans un canal (étapes 4.1, 4.2 et 5)</td></tr><tr><td>Lignes pour l’unité fluidique (ensemble de perfusion JAUNE et VERT)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Permet de configurer le dispositif fluidique pour administrer une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum dans un canal (étapes 4.1, 4.2 et 5). Remarque : les deux lignes peuvent également être coupées dans le tube de 1,6 mm (numéro de catalogue 10842).</td></tr><tr><td>Ligne pour le drain (tube de 1,6 mm de diamètre intérieur)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Permet de configurer le dispositif fluidique pour administrer une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum dans un canal (étapes 4.1, 4.2 et 5).</td></tr><tr><td>Microscope inversé Zeiss Observer.Z1 équipé d’un objectif à huile 40X/1,3 et d’un objectif à air 20X/0,3 (ou une alternative comparable)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Utilisé pour imager des cellules D. discoideum avec un éclairage en contraste de phase ou en fluorescence (étapes 4 et 5)</td></tr><tr><td>Microscope confocal à disque rotatif UltraView équipé d’un capteur 40&times ;/1.25&ndash ; Objectif à huile 0,75 (ou une alternative comparable)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Une alternative utilisée pour l’imagerie des cellules D. discoideum (étape 4.1.4)</td></tr><tr><td>Microinjecteur FemtoJet (Eppendorf ; modèle 5247, ou une alternative comparable) avec Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D et 5192000027</td><td>Utiliser pour administrer une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum à l’aide d’une micropipette (étape 4.3). Remarque : les numéros de catalogue sont pour la version la plus récente de l’équipement (4i).</td></tr><tr><td>Micropipette (Femtotip ; 1 &mu ; m de diamètre extérieur, 0,5 &mu ; m de diamètre intérieur )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Utiliser pour fournir une stimulation mécanique aux cellules D. discoideum à l’aide d’une micropipette (étape 4.3)</td></tr><tr><td>Embouts de microchargeur (Eppendorf Femtotips Microloader pour micro-injecteur Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Utiliser pour remplir la micropipette (femtotip) avec tampon (étape 4.3.1)</td></tr><tr><td>Chambre à 1 puits (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Utiliser pour plaquer les cellules D. discoideum pour une stimulation mécanique administrée par une micropipette (étape 4.3.2)</td></tr><tr><td>Chambre à 8 puits (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Utiliser pour plaquer les cellules D. discoideum pour la stimulation mécanique délivrée par ajout de tampon en vrac (étape 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fidji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Utilisation pour quantifier la réponse à la stimulation mécanique (étape 4.5)</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de migration (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Utiliser pour quantifier la vitesse et la persistance des cellules (étape 5.4)</td></tr></tbody></table>

Évaluation de dictyostelium discoideum réponse à la stimulation mécanique aiguë

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chimiotactisme, ou la migration vers le haut une pente d’un facteur chimiotactique, est le mode le mieux compris de migration dirigée. Des études utilisant l’amibe sociale Dictyostelium discoideum a révélé qu’un réseau de transduction de signal complexe de voies parallèles amplifie la réponse à chimioattractants et mène à la polymérisation de l’actine biaisée et saillie d’un pseudopodes dans le direction d’un dégradé. En revanche, les mécanismes moléculaires conduisant des autres types de migration dirigée, par exemple, en raison de l’exposition pour cisailler des flux ou des champs électriques, ne sont pas connus. De nombreux régulateurs de la chimiotaxie pièce localisation à la tête ou bord de calorifugeage d’une cellule de migration, ainsi que montrent des changements transitoires localisation ou activation suite à la stimulation globale avec un facteur chimiotactique. Pour comprendre les mécanismes moléculaires d’autres types de migration dirigée, nous avons développé une méthode qui permet l’examen de la réponse cellulaire à la stimulation mécanique aiguë en bref (2 à 5 s) une exposition aux flux de cisaillement. Cette stimulation peut être livrée dans un canal tout en imagerie de cellules exprimant des biocapteurs fluorescent marqué afin d’examiner le comportement des cellules individuelles. En outre, la population de cellules peut être stimulée dans une assiette, lysées et l’immunoblotted en utilisant des anticorps qui reconnaissent les versions actives des protéines d’intérêt. En combinant les deux tests, on peut examiner un large éventail de molécules activées par des changements dans la localisation sous-cellulaire et/ou la phosphorylation. En utilisant cette méthode, nous avons déterminé que la stimulation mécanique aiguë déclenche l’activation des réseaux chimiotactique signal transduction et actine cytosquelette. La possibilité d’examiner les réponses cellulaires à la stimulation mécanique aiguë est importante pour comprendre les événements déclencheurs nécessaires pour la motilité induite par le flux de cisaillement. Cette approche fournit également un outil pour l’étude du réseau de transduction de signal chimiotactique sans l’influence de confusion du récepteur facteur chimiotactique.

Réponse temporelle des régulateurs de la chimiotaxie à la stimulation mécanique aiguë
Pour évaluer la réponse des cellules de d. discoideum à la stimulation mécanique, cellules capables d’agrégation adhérentes ont été exposés à une brève impulsion d’un écoulement cisaillé. Discoideum capables d’agrégation D. cellules sécrètent le cAMP, qui pour être perçu par les cellules voisines. Pour remédier à la contribution ...

Nous décrivons ici les méthodes d’évaluation de la réponse cellulaire à la stimulation mécanique aiguë. Dans l’analyse axée sur la microscopie, nous examinons la localisation des biocapteurs fluorescent marqué après stimulation brève avec un écoulement cisaillé. Nous testons également l’activation de différentes protéines d’intérêt en réponse à une stimulation mécanique aiguë biochimiquement.

Évaluation de Dictyostelium discoideum réponse à la Stimulation mécanique aiguë

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

L’objectif général de cette procédure est d’examiner l’activité de divers composants du réseau de transduction du signal intracellulaire à la suite d’une brève perturbation mécanique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la migration cellulaire, telles que la façon dont les cellules détectent et migrent vers divers signaux environnementaux, y compris les stimuli mécaniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’examiner la réponse initiale à un stimulus mécanique sans la contribution confondante de la motilité ou de la polarité à la réponse.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons testé la réponse des cellules adhérentes au chimioattractant qui était délivré avec une légère agitation et nous avons remarqué une réponse robuste des cellules stimulées par le contrôle du véhicule. Pour commencer, préparez Klebsiella aerogenes en inoculant un petit nombre de cellules de stock congelé dans un milieu HL5 sans antibiotiques et incubez la culture pendant la nuit. La croissance de Dictyostelium en présence de bactéries Klebsiella aerogenes réduira le nombre de macropinosomes, ce qui améliorera la réponse cellulaire aux stimuli externes.Chronométrez l’expérience de sorte que lorsque les bactéries sont prêtes, il y a du Dictyostelium qui croît de façon exponentielle. Prélevez ces cellules de Dictyostelium et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, étalez 260 microlitres de la suspension bactérienne contenant 100 000 cellules de Dictyostelium sur une plaque SM.Également pour l’assurance, préparez des plaques avec deux fois plus et deux fois moins de cellules Dictyostelium. Après une journée de croissance à température ambiante, inversez la plaque et continuez la culture de la plaque jusqu’à ce que les cellules Dictyostelium commencent à nettoyer la pelouse bactérienne mais n’ont pas encore commencé à s’agréger. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon DB dans la plaque et grattez le Dictyostelium à l’aide d’un épandeur de verre.Transférez les cellules et la solution dans un tube en polypropylène de 50 millilitres, puis rincez la plaque avec cinq autres millilitres de DB et ajoutez-le également dans le tube de 50 millilitres. Répétez l’opération si nécessaire. Pour laver le Dictyostelium, remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres de DB, granulez les cellules, puis aspirez et jetez le surnageant.Lavez les cellules à plusieurs reprises jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Enfin, réintroduisez le Dictyostelium dans le tampon DB à environ cinq millions de cellules par millilitre. Pour commencer, déposez deux millions de Dictyostelium compétents en agrégation sur des plats de 35 millimètres avec deux millilitres de DB. Préparez une assiette pour chaque point temporel et un témoin non stimulé.À température ambiante, laissez les cellules se fixer à la plaque pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules non attachées de la plaque à l’aide de deux rinçages avec un millilitre de DB. Une fois que les plaques sont débarrassées du dictyostelium non attaché, incubez les cellules attachées dans un tampon de basolation pendant 30 minutes sans déranger les plaques. Il est très important d’éviter tout mouvement des plaques pendant l’incubation d’une demi-heure pour éviter une stimulation prématurée des cellules.Maintenant, pour appliquer une quantité contrôlée de stimulation mécanique, transférez individuellement une plaque dans un agitateur orbital et faites fonctionner l’agitateur à 150 tr/min pendant cinq secondes. Ensuite, après le temps souhaité, aspirez le tampon et placez rapidement la plaque sur de la glace. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon d’échantillon avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase et grattez les cellules.Recueillez le lysat dans des tubes de 1,5 millilitre et chauffez-les rapidement à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Procédez à l’analyse du lysat ou transférez-le à moins 20 degrés Celsius pour le stockage. Après avoir mis en suspension des cellules végétatives ou compétentes en agrégation, chargez environ 600 microlitres dans la lame de la chambre microfluidique.Les entrées doivent être complètement remplies, alors complétez-les avec un tampon si nécessaire. Laissez les cellules se fixer pendant 10 minutes. Connectez une ligne d’entrée pour l’appareil à une pompe électronique avec un réservoir de 15 millilitres.À l’aide du contrôle logiciel de la pompe, fermez la vanne, puis remplissez le réservoir avec DB. Maintenant, réglez la pression sur 50 millibars et allumez la pompe. Remplissez et rincez la conduite avec DB en cliquant sur la vanne pour l’ouvrir. Après avoir rincé pendant environ 30 secondes, remettez la pression à zéro, puis fermez la vanne.Ensuite, connectez la ligne à l’une des trois entrées d’un côté de la glissière. Ne piégez pas de bulles d’air et une fois la connexion établie, couvrez les deux autres entrées de ce côté de la glissière. Maintenant, terminez la configuration en connectant la conduite du drain à la sortie unique du côté opposé de la glissière.Ensuite, sous un éclairage en fond clair ou en phase sur un microscope fluorescent, visualisez le canal avec un objectif à air 20X et rincez le canal. Ensuite, réglez la pression à environ 50 millibars et ouvrez la vanne. Une fois que le liquide sort du drain, réduisez la pression externe à zéro, attendez environ 30 secondes et fermez la vanne.Ensuite, passez à l’objectif à huile 40X, concentrez-vous sur la partie la plus large du canal et préparez le logiciel à collecter des images toutes les trois secondes avec un éclairage RFP ou GFP. Avec la vanne fermée, réglez la pression sur la valeur souhaitée. Ensuite, acquérez cinq images de pré-stimulation à trois secondes d’intervalle.Ensuite, ouvrez brièvement la valve pour délivrer le stimulus. Maintenant, collectez au moins 15 images de données supplémentaires sur 45 secondes. Quantifiez la réponse telle que décrite dans le protocole textuel.Tout d’abord, chargez une lame microfluidique avec du Dictyostelium comme décrit dans la section précédente. Pour cette expérience, préparez deux lignes d’entrée. Pour fermer les lignes, utilisez une pince physique sur la ligne transportant la solution de traitement et la vanne commandée par logiciel pour fermer la ligne transportant la solution DB avec le véhicule.Maintenant, remplissez les deux lignes avec la solution appropriée, tampon plus véhicule seul ou tampon avec le traitement tel qu’un inhibiteur. Une fois les conduites rincées, connectez-les à deux entrées sur le côté de la glissière avec le canal et bouchez l’entrée inutilisée. Ensuite, connectez la conduite de vidange à la sortie du côté opposé.Maintenant, lavez la diapositive à l’aide du tampon plus le véhicule comme décrit précédemment. Ensuite, remplissez le canal avec le traitement. Tout d’abord, réduisez le débit à zéro millibar.Ensuite, changez les vannes, faites couler le traitement pendant environ 15 secondes et commencez à chronométrer l’incubation. Toutes les 10 minutes environ, versez une nouvelle solution de traitement sur les cellules pendant environ 15 secondes pour reconstituer les niveaux d’oxygène dans la chambre. Les cellules adhérentes compétentes en agrégation ont été exposées à cinq secondes d’écoulement de cisaillement à l’aide d’un agitateur orbital.Les Dictyostelium ont été prétraités avec de la caféine pour réduire leur activité basale. En conséquence, il y avait une très faible activité basale de PKBR1 et ERK2 et une augmentation robuste de la phosphorylation des résidus clés de ces kinases avec la stimulation. Dans les cellules compétentes en agrégation exprimant divers biocapteurs marqués par fluorescence, deux marqueurs de bord d’attaque, PHcrac et LimE, qui sont recrutés par PIP3 ou l’actine nouvellement polymérisée, ont tous deux montré une localisation principalement cytosolique dans les cellules au repos.Après cinq secondes de flux de cisaillement, ces biocapteurs se sont rapidement relocalisés dans le cortex et sont retournés au cytosol. Les effets de la latrunculine A, un médicament dépolymérisant l’actine, ont été testés à l’aide d’une expérience similaire sur la force de cisaillement. Dans ce cas, les cellules végétatives ont d’abord été exposées à des conditions de contrôle, puis passées au tampon contenant l’agent d’essai souhaité.Le traitement à la latronculine A a bloqué la relocalisation des marqueurs de bord d’attaque dans le cortex. Curieusement, si le flux n’a pas été interrompu après deux secondes mais est resté allumé pendant toute la durée de l’expérience, une réponse globale transitoire a tout de même été observée. Suite à la réponse globale, les cellules végétatives ont migré à contre-courant.Une bonne préparation des cellules est extrêmement importante pour le succès de ces tests. Les cellules végétatives doivent être cultivées en association avec des bactéries pour assurer leur réactivité à la stimulation mécanique. Pour les cellules compétentes en agrégation, les cellules qui sont sous-développées ou surdéveloppées ont tendance à mal répondre.Les approches biochimiques et microscopiques se complètent, ce qui nous a permis d’évaluer un grand nombre d’intermédiaires de transduction du signal pour leur réponse à la stimulation mécanique. En ajoutant des perturbations pharmacologiques et génétiques, nous pouvons apprendre comment les stimuli mécaniques sont perçus et transmis. Ceci est important pour comprendre la migration cellulaire dirigée qui est guidée par des stimuli physiques tels que le flux de cisaillement.Étant donné que la stimulation mécanique déclenche l’activation du même réseau de transduction de signal que les chimioattractants, nous pouvons maintenant examiner l’intégration de divers stimuli sur les cellules. En fin de compte, ces études nous aideront à comprendre comment les cellules migratrices telles que nos propres cellules immunitaires et les cellules cancéreuses métastatiques naviguent dans le corps.

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