Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer des protéines de surface sur des mycobactéries en utilisant la décoration de surface avec des protéines recombinantes comme alternative aux approches traditionnelles basées sur la génétique. Ces méthodes peuvent aider à répondre à d’importantes questions de recherche dans le domaine de la mycobactériologie, en particulier dans le domaine des interactions hospitalières et du développement de vaccins. Cette technique peut être utilisée pour dépister les facteurs d’interférence potentiels ou les candidats antigènes.

Il peut être le et rapidement comparé aux approches génétiques traditionnelles fastidieuses et chronophages. Amina Talal, assistante de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Cette partie du protocole commence par la transformation du plasmide P17 Aviden OVA en E.Coli BL21.

Pour ce faire, induisez 250 millilitres de culture d’E.Coli BL21 avec IPTG pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Après trois heures, lysons les bactéries pour solubiliser les corps d’inclusion en granulant d’abord la culture BL21 induite et en jetant le surnageant. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon de lyse et laissez les cellules être lysées pendant 15 minutes.

Poursuivez ensuite l’incubation à température ambiante à l’aide d’un rotateur pour agiter et laissez-le aller toute la nuit. Le matin, centrifugez le mélange pendant une demi-heure. Prélever ensuite le surnageant contenant les corps d’inclusion solubilisés.

Ensuite, purifiez les protéines OVA d’Aviden à l’aide d’une colonne de nickel NTA. Tout d’abord, diluez le surnageant un à deux dans un tampon de lyse et estimez le volume. Préparez ensuite une colonne contenant quatre millilitres de résine de nickel NTA pour 250 millilitres de surnageant dilué et chargez la dilution sur la colonne.

Ensuite, lavez la colonne trois fois à l’aide de 10 millilitres de tampon de lyse à pH sept par lavage. Pour recueillir la protéine recombinante, laver la colonne avec un tampon de lyse contenant de l’imidazole et recueillir l’éluat. Si votre protéine recombinante est exempte de corps d’inclusion, la procédure suivante sera bénéfique pour de nombreuses protéines dans notre laboratoire.

Tout d’abord, ajustez le pH de la solution de repliement pour qu’il soit d’une unité au-dessus ou en dessous du point isoélectrique de la protéine. Ensuite, vortex progressivement et diluez la protéine à une dilution de 1 à 10 dans une solution de repliement. Ensuite, incubez la protéine sur un agitateur magnétique pendant 30 minutes à température ambiante pour terminer le processus de repliement.

Ensuite, le dessalage et le tampon échangent les protéines repliées en PBS à l’aide d’un concentrateur de protéines. Poursuivez en centrifugeant la colonne et stockez les aloquats de protéines solubles à 20 degrés Celsius. Travailler dans une enceinte de biosécurité à l’aide d’un équipement de protection individuelle, car le BCG est un agent pathogène de niveau 2.

Pour biotinyler la surface des cellules BCG, cultivez d’abord les cellules sur une plate-forme de shaker à la bonne densité. Prélevez environ un milliard de cellules et lavez-les trois fois à l’aide de 500 microlitres de PBST glacé et sans endotoxines. Ensuite, faites tourner les cellules et suspendez-les dans du PBS stérile et sans endotoxines.

Ensuite, préparez de la biotine sulfo-NHSSS fraîche de 10 millimolaires dans de l’eau filtrée stérile. Ensuite, incubez les bactéries dans un millilitre de bouillon contenant 0,5 millimolaire de biotine sulfo-NHSSS. Effectuez l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez trois fois les bactéries maintenant étiquetées avec 500 microlitres de PBST glacé, comme précédemment pour éliminer le réactif qui n’a pas réagi. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBST. Pour évaluer l’efficacité de la biotinylation, colorez un aloquat de 100 millions de BCG biotinylé avec 25 microlitres de Strepravidin-FITC.

Ensuite, incubez brièvement les bactéries colorées dans du para-formaldéhyde, puis mesurez le niveau de biotinylation à l’aide de la cytométrie en flux. Après avoir évalué la croissance et la survie des mycobactéries biotinylées, procédez à la liaison de la protéine de fusion Aviden à celles-ci. Tout d’abord, mélangez 500 millions de BCG biotinylés avec la protéine de fusion Aviden pour une concentration finale de 10 microgrammes de protéines par millilitre.

Laissez cette réaction se dérouler pendant une heure à température ambiante sur un shaker. Ensuite, lavez les bactéries trois fois avec 500 microlitres de PBST glacé. Colorez ensuite les bactéries avec un anticorps anti-Aviden de lapin pendant 20 minutes à température ambiante.

Après 20 minutes, effectuez une étape de lavage avec 500 microlitres de PBST glacé. Ensuite, colorez la bactérie avec l’anticorps IGG anti-lapin de chèvre conjugué à la FITC. Ensuite, lavez les bactéries à l’aide de 500 microlitres de PBST glacé et analysez les bactéries par cytométrie en flux pour évaluer la décoration de la surface.

Après avoir suivi le protocole décrit, la cytologie montre qu’il y avait des niveaux minimes de liaison de l’OVA aux bactéries non biotinylées et des niveaux significatifs de liaison de l’OVA aux bactéries biotinylées. Il est important de noter que les niveaux d’Aviden OVA à la surface bactérienne sont restés stables et détectables un mois après la lyophilisation et le stockage à température ambiante. Ensuite, des cellules RAW et des bactéries dsRed ont été utilisées pour effectuer un test de phagocytose.

Heureusement, il n’y avait pas de dissuasion dans le phénotype des macrophages. Pour examiner le devenir des BCG décorés d’Aviden OVA dans les macrophages, les cellules RAW adhérentes ont été infectées et examinées par microscopie à fluorescence. Aviden OVA n’était pas seulement présent à la surface de la bactérie, mais également détaché et translocalisé dans le cytoplasme loin de la bactérie.

Une expérience de coloration immuno-or a montré que les antigènes OVA d’Aviden peuvent se détacher de la surface du BCG, traverser la membrane phagosomale et se déplacer vers le cytosol. Les macrophages infectés par Aviden OVA BCG ont montré une co-localisation d’Avi OVA avec des molécules IA. Cela suggère que les protéines de fusion Aviden se détachent et se déplacent dans les compartiments de présentation de l’antigène pour être chargées sur les molécules du CMH2.

Les peptides OVA d’Aviden sont également co-localisés avec des molécules de classe I dans les phagosomes du BCG, comme le montre la coloration H2K. Ainsi, il existe une présentation potentielle de l’antigène Avi OVA aux lymphocytes T CD8 positifs par le macrophage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer les protéines chez les mycobactéries, et cet organisme est difficile à manipuler avec les méthodes génétiques actuelles.

Après la technique, nous l’utilisons avec succès pour charger le vaccin avec l’antigène de la mycobactérie est à six. Ensuite, nous avons montré que les vaccins modifiés étaient susceptibles d’être utilisés comme réponse immunitaire spécifique dans le modèle murin. Nous collaborons actuellement avec nous pour explorer cette approche dans la tératine Nous avons proposé d’utiliser le BCG amélioré avec des antigènes ou des immunobulateurs sélectionnés.