Name: Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Découvrez une méthode de décoration de surface non génétique pour exprimer des antigènes exogènes sur Mycobacterium bovis BCG via le système avidine-biotine. Cette technique rapide améliore l'immunogénicité pour le développement vaccinal.

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Nous remercions le Dr R Stokes pour la souche de BCG Pasteur et A. Talal pour le support technique. Nous remercions également GenScript pour aide à la synthèse de gènes.

Tous les animaux ont été maintenues conformément aux protocoles approuvés par les comités de l’emploi à l’Université de la Colombie-Britannique et animalier. Expériences ont été approuvés par les comités de l’utilisation et de protection des animaux et interprétés selon le Canadian Council on Animal Care lignes directrices. Le nombre de bien-être des animaux assurance est A11-0247.
1. génération des protéines de Fusion de monomère avidine exprimant des plasmides
<ol><li>Cloner l’avidine monomère séquence12 dans le plasmide pDEST17 entre les sites « CCT » et « GAA » qui correspond à 133-134bp. (c'est-à-direentre la 6-histag et le site de recombinaison Attr1 pDEST17) pour obtenir p17-Avi. Remarque : La séquence d’ADN de monomère avidine est illustrée ci-dessous. Les trois mutations introduites en avidine sauvage pour obtenir l’avidine monomère sont indiquées en caractères gras. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc STCATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Concevoir des amorces flanqués de sites AttB1 et B2 Attcorrespondant aux ovules polypeptide757-1035 (I-Ab- et H-2_Kb-restreint des épitopes) séquence d’ADN. Séquences d’amorces sont : Attb1-OVA B2-OVA TCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTgirot et Att GIROTACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 et b2 des Attséquences figurent en caractères gras).<ol>
<li>PCR-amplifier OVA757-1035 ADN séquence polypeptidique avec les amorces ci-dessus en utilisant le plasmide pUC57-OVA comme gabarit.</li>
		<li>Cloner les produits PCR dans pDONR-221 à travers une in situ in vitro réaction de recombinaison (p. ex., Clonase BP) pour obtenir des pDONR-OVA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer le gène d’intérêt dans p17-Avi à l’aide de la réaction Clonase LR pour obtenir p17-Avi-OVA. Remarque : Pour plus de détails de clonage de recombinaison BP et LR, voir le manuel du constructeur.</li>
</ol>2. monomère avidine Fusion Protein Expression, Purification et repliement
<ol><li>Transformer le plasmide p17-Avi-OVA en e. coli BL21 et induire de 250 mL d’e. coli BL21 culture avec IPTG (0,1 M) pendant 3 h à 37 ° C.</li>
	<li>
Lyse des bactéries et la solubilisation des corps d’Inclusion
	<ol>
<li>Granule le 250 mL de la culture BL21 induite par 30 min de centrifugation à 4 000 x g et 4 ° C.</li>
		<li>Recueillir des granulés dans 10 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 Guanidine-HCL, pH 1,5 à 2,5 M) et incuber pendant 15 minutes à 95 ° C. Incuber une nuit à température ambiante sur un agitateur.</li>
		<li>Centrifuger 30 min à 15 000 x g et 4 ° C et à frais viré surnageant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purifier Avi-OVA de surnageant (Fraction solubilisée corps d’Inclusion) à l’aide de colonnes Ni-NTA.
	<ol>
<li>Diluer les corps d’inclusion 1:2 avec tampon de lyse.</li>
		<li>Utilisez 4 mL de résine Ni-NTA par 250 mL de corps d’inclusion dérivées de la culture.</li>
		<li>Laver 3 x 10 ml de tampon de lyse (pH 7,0).</li>
		<li>Éluer avec 10 mL de tampon d’élution (lyse tampon pH 7.0 avec imidazole 250 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replier la protéine éluée par dilution progressive (01:10) et une agitation rapide dans un tampon Tris (pH 7.5) contenant 1 millimètre DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginine 500 mM et 200 mM NaCl pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Hors sel et échange tampon replié protéine de tampon Tris dans PBS avec concentrateurs de protéines selon les protocoles du fabricant.</li>
	<li>Supprimer des agrégats par centrifugation pendant 30 min à 3 500 g x et à 4 ° C et stocker les aliquotes de protéine soluble à-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylation de Surface cellulaire de BCG
<ol><li>Croître BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min jusqu'à OD = 0,5-1. Remarque : Le BCG est un pathogène de niveau 2 de biosafety et toutes les expériences concernant le BCG devraient être faites dans une armoire avec un équipement de protection personnels de biosécurité.</li>
	<li>Lavez 109 BCG 3 fois avec 500 µL de PBS gratuit endotoxine glacee plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0). Suspendre pastille de BCG dans du PBS gratuit endotoxine stérile.</li>
	<li>
Immédiatement avant l’emploi, préparer 1 mL de biotine Sulfo-NHS SS 10 mM dans l’eau filtrée stérile.
	<ol>
<li>Incuber les bactéries avec 1 mL de 0,5 mM de biotine Sulfo-NHS SS à température ambiante pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laver les bactéries marqués 3 fois avec 500 µL de glacé PBST froid pour enlever non-réagi biotinylation réactif.
	<ol>
<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluer l’efficacité biotinylation, tache 108 biotinylé BCG avec streptavidine-FITC (au 1/100, 25 µL) à température ambiante pendant 20 min.
	<ol>
<li>Incuber les bactéries colorées dans 1 mL de 2 % PFA pendant 20 min à température ambiante et ensuite examiner les niveaux de biotinylation par analyse en cytométrie en flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. phénotype des mycobactéries biotinylés : croissance et survie
<ol><li>
Croissance des souches de BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min.
	<ol>
<li>Enregistre la densité optique (OD600) de la culture bactérienne pendant une période de 8 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilisez le BCG-Luc (décrite précédemment9) pour détecter la survie des bactéries dans les macrophages.
	<ol>
<li>Infecter les cellules RAW264.7 avec biotinylé BCG-Luc (MOI 10:1) ou non traitées par le BCG-Luc (contrôle) et incubé à 37 ° C sur un 48 h de délai.</li>
		<li>Laver les monocouches de cellules et puis lyse avec 0.025 % SDS pour libérer des bactéries ingérées.</li>
		<li>Mesurer la production de bioluminescence avec système de dosage de luciférase et luminomètre. NOTE : Signal de Luminescence est révélatrice de la viabilité bactérienne. Veuillez consulter le manuel du fabricant pour plus de détails de l’analyse de luciferase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. la liaison de la protéine avidine-Fusion monomère à Surface de BCG biotinylés
<ol><li>Mélanger 5 x 108 biotinylé BCG avec Avi-protéine (10 μg/mL final PBS-T) pendant 1 h à température ambiante sur la plate-forme agitatrice.</li>
	<li>Bactéries de laver 3 fois avec 500 µL de PBST froid glacé et tache avec anticorps de lapin anti-avidine (Ab) (dilution 1 : 100, décrites précédemment10) pendant 20 min à température ambiante, puis à la FITC conjuguent anti-lapin de chèvre Ab IgG dans les mêmes conditions.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 500 µL de PBST, les bactéries et d’analyser par cytométrie de flux pour évaluer l’ampleur de la décoration de surfaces.</li>
</ol>6. la lyophilisation des mycobactéries
<ol><li>Biotinylater bactéries selon l’étape 3.1 à 3.4 et manteau biotinylé bactéries avec Avi-OVA selon étape 5.1.</li>
	<li>Aliquote biotinylé et enduits bactéries (108), laver avec du PBS et remettre en suspension dans 0,5 mL de milieu de lyophilisation (1,5 % milieu de Sauton de 25 % et 75 % H2O Na-glutamate).</li>
	<li>Transférer des bactéries de flacons en verre et congeler dans un congélateur à-80 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Lyophiliser les flacons en verre remplis et congelés pendant 24 h à l’aide d’un gel du séchoir.</li>
	<li>Stocker les échantillons séchés à température ambiante et reconstituer dans du PBS quand nécessaire.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.5 pour évaluer la biotinylation et stabilité de revêtement de surface.</li>
</ol>7. phagocytose Assay
<ol><li>Grandir 264.7 cellules macrophages dans les récipients de culture de diamètre de 10 cm en DMEM moyen contenant 5 % FCS, 1 % de L-glutamine, HEPES, acides aminés non essentiels et la pénicilline et la streptomycine jusqu'à la confluence de 70 à 80 %.</li>
	<li>2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages dans une plaque 6 puits de graines. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Générer la DsRed BCG (décrite précédemment9) décoré avec Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) selon les étapes 3.1 à 3.4 et 5.1.</li>
	<li>Infecter les cellules RAW avec DsRed BCG-Avi-OVA ou non traitée DsRed BCG à MOI 20:1 pendant 24 h à 37 ° C.</li>
	<li>Laver trois fois les cellules et trypsinize en utilisant 1 mL de 0,25 % de trypsine à 37 ° C pendant 10 min pour éliminer les bactéries partiellement détachées.</li>
	<li>Difficulté à 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois avec du PBS et d’analyser par cytométrie en flux.</li>
</ol>8. intracellulaire d’oeufs décorés biotinylé BCG dans les Macrophages
<ol><li>
Microscopie en fluorescence
	<ol>
<li>Graines de 3 x 105 RAW 264.7 cellules de macrophages sur les lamelles dans une assiette de 24 puits. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Infecter les cellules macrophages avec mycobactéries (MOI 10:1) dans les médias de maintenance sans antibiotiques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 à 24 h.</li>
		<li>Laver les cellules et trypsinize pour supprimer la surfaces bactéries non ingéré, attachés comme à l’étape 7,5.</li>
		<li>Cellules Fix infecté dans 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante suivi par 3 lavages avec du PBS.</li>
		<li>Permeabilize des cellules dans un tampon bloquant/perméabilisation (0,1 % X-100 Triton, 3 % de BSA dans du PBS) pendant 20 min à température ambiante.<ol>
<li>Anticorps spécifiques d’utilisation d’intérêt (p. ex., lapin anti-avidine Ab) à 10 μg/mL en perméabilisation tampon pendant 20 min à température ambiante suivi d’anticorps secondaire (p. ex., IgG anti-lapin FITC-chèvre) pendant 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laver les cellules 3 fois avec du PBS, une fois avec de l’eau monter sur diapositives de 10 μl de milieu de montage aqueux pour réduire au minimum le photoblanchiment de fluorescence.</li>
		<li>Examiner les diapositives de la microscopie confocale numérique à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé x 63 / 1.4 objectif Plan-Apochromat. Enregistrer des images à l’aide d’un appareil photo numérique couplé au logiciel de microscope.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La coloration immunologique à l’or et la microscopie électronique
	<ol>
<li>Graines de 2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages en plaques 6 puits.</li>
		<li>Difficulté des macrophages infecté par le BCG avec 4 % PFA pendant 4 h à température ambiante.</li>
		<li>Échantillons de laver deux fois avec du PBS.</li>
		<li>Intégrer des échantillons dans l’agarose de bas point de fusion de 4 % et déshydrater dans l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Transfert des échantillons de résine acrylique et polymériser à 50 ° C.</li>
		<li>Découper 60 sections nm avec un microtome et recueillir des sections sur les grilles de nickel.</li>
		<li>Étiqueter les échantillons avec 10 μg/mL d’anticorps avidine pendant 1 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit dans une solution d’incubation (BSA PBS et 0,1 %) et laver ensuite avec incubation solution conjugué or f2 ultra petite chèvre-anti-lapin IgG (1/20) pendant 1 h à la salle température dans la solution d’incubation.</li>
		<li>Laver les sections dans l’eau distillée, tache au glutaraldéhyde à 2 %, laver, sécher à l’air, puis examinez au microscope électronique à.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. animale vaccination et traitement de l’orgue
Remarque : Toutes les mesures devraient être prises dans une armoire de sécurité biologique.
<ol><li>Col biotinylé et protéine enduit bactéries à travers 271/2G aiguille 10 fois de faire suspension monocellulaire.</li>
	<li>
Prendre 1 x 106 bactéries dans 100 μl de PBS exempte d’endotoxine et immuniser une souris C57BL/6 femelles (I-A,b, H - 2 Kb, vieux de 5 à 6 semaines) par voie sous-cutanée dans la peau du cou.
	<ol>
<li>Injecter des souris témoins avec 100 μl de PBS seul.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Euthanasier souris immunisées 20 jours après la vaccination par inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale.
	<ol>
<li>Isoler la rate et transférez-le dans milieu RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purée de rate à travers un tamis de cellule de 70 µm avec un piston de seringue de 5 mL.
	<ol>
<li>Laver avec 5 mL de RPMI. Centrifugeuse (800 x g, 3 min) pour isoler une suspension monocellulaire.</li>
		<li>Appauvrissent la RBC avec kit de sélection positive de biotine de souris avec des cellules érythroïdes-Ter119/biotine Ab.</li>
		<li>Centrifuger et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de RPMI complet (FCS de 10 %, 1 % L-glutamine, pénicilline 1 %, 1 % streptomycine et 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. I-Ab tétramère de coloration pour déterminer les fréquences de spécifiques à l’antigène CD4+ des cellules T et intracellulaire Cytokine coloration pour déterminer des fréquences de spécifiques à l’antigène T cellules libérant Cytokines chez les animaux vaccinés
<ol><li>
Tétramère coloration
	<ol>
<li>Tache de splénocytes de contrôle et de la souris immunisées (~ 20 x 106 cellules) avec conjugué PE I-Ab-tétramères de323-339 OVA (dilution 1/12,5) pendant 1 h à 37 ° C dans le tampon de liaison (PBS avec FCS 2 % et 0,1 % NaN3).</li>
		<li>Ajouter AF647 CD4 Ab (01:25) et 7-AAD (pour détecter les cellules mortes) de splénocytes pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Analyser des échantillons par cytométrie en flux.</li>
		<li>Acquérir 500 000 événements dans la région de CD4 positif afin de déterminer la fréquence d’événements positifs tétramère. NOTE : Total splénocytes sont définies par la tache de dot SSC/FSC, des cellules vivantes par l’exclusion des événements positifs 7-AAD, ainsi que ses sous-ensembles CD4 par le déclenchement des événements positifs AF647.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fréquence de l’antigène spécifique Intracellular Cytokine libérant des lymphocytes T
	<ol>
<li>Transfert environ 1 × 107 splénocytes dans 4 mL de milieu RPMI complet en six plats avec ou sans ovules recombinantes (10 µg/mL) et incuber pendant 16 h.</li>
		<li>Traiter les cellules avec la bréfeldine A (1:1, 000) pendant 5 h supplémentaires.</li>
		<li>Laver avec du PBS et sous réserve de la cytokine intracellulaire coloration comme suit :<ol>
<li>Une coloration des échantillons de cellules avec PE-CD8 ou PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 dans le tampon de liaison) à température ambiante pendant 30 min.</li>
			<li>Difficulté à 4 % PFA à température ambiante pendant 20 min.</li>
			<li>Permeabilize à l’aide de la solution de la perméabilisation, selon les instructions du fabricant.</li>
			<li>Laver les cellules et étiquette avec conjugué AF647 IFN-γ Ab (01:50) pendant 20 min à température ambiante.</li>
			<li>Laver les cellules et soumis à l’analyse en cytométrie en flux, comme décrit ci-dessus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li>
<li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li>
<li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li>
<li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li>
<li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li>
<li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li>
<li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li>
<li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+%2899m%29+Tc-HMPAO-labelled+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li>
<li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+an+active+avidin+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li>
<li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li>
<li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li>
<li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunotherapy+of+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li>
<li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+%28H1N1%29pdm09+virus%3A+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li>
<li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li>
<li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li>
<li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles%2C+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li>
<li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li>
<li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunolLett%22%5BJournal%5D)">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li>
<li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biother+Radiopharm%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li>
<li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons rapporté dans cette étude une approche non génétiques pour un affichage rapide et efficace des protéines exogènes sur surface de BCG pour ajouter des antigènes spécifiques ou des propriétés fonctionnelles spécifiques censées améliorer efficacement l’immunogénicité de la bactérie. Nous avons démontré que la surface des cellules BCG pourrait être facilement biotinylé pour la décoration de surface instantanée avec des protéines de fusion de l’avidine. La procédure totale peut être effectuée dans les 2 h, tandis q...

Diverses stratégies ont été proposées pour remplacer l’actuel TB vaccin BCG, y compris les protéines adjuvant systèmes, technologies vectorisées virales, souches vivantes atténuées de tuberculosis et des souches de BCG génétiquement modifiées, soit pour introduire des gènes surexprimant les antigènes BCG qui ne sont pas suffisamment exprimées au cours de l’infection1 ou VTT-antigènes spécifiques non présent dans le BCG2. Génie génétique, cependant, est confrontée à de nombreux obstacles y compris le niveau incertain de la sécurité, le processus fastidieux et la faible efficacité de vecteurs d’expression,4,5. En ce qui concerne l’amélioration de BCG, une autre approche est nécessaire pour améliorer l’immunogénicité sans la nécessité d’alternances génétiques incertains.
Dans cette étude, nous introduisons une nouvelle stratégie pour l’affichage des protéines recombinantes d’intérêt sur la surface des cellules par le BCG qui repose sur l’interaction de l’avidine bien connue de haute affinité avec de la biotine. Cette approche permet une fixation rapide et reproductible des protéines de fusion recombinantes avidine sur la surface de biotinylé BCG, ce qui facilite les manipulations larges de BCG à réaliser une amélioration maximale de son efficacité tout en conservant son excellente sécurité enregistrer, observé au cours des décennies d’utilisation.
L’avidine affinité pour la biotine est extrêmement élevée (Kd = 10−15 M) et une fois formé, le complexe biotine-avidine est très stable et peut seulement être perturbé sous dénaturer des conditions6. Toutefois, pour ce type d’interaction pour servir comme une alternative de méthode de transfert de gène, affichage à long terme mais réversible de protéines recombinantes est requise. Ainsi, nous avons introduit ici une avidine monomère de faible affinité (Kd = 10−7 M) que mène à la libération réversible de protéines de la surface décorée BCG ingéré une fois à l’intérieur de cellules présentatrices. Afin de fournir une preuve de concept, nous avons testé cette méthode en utilisant une protéine chimérique avidine monomère correspondant à un antigène de substitution provenant d’ovalbumine (OVA)7,8. Les résultats ont montré que la surface des cellules par le BCG peut être facilement et rapidement décorée avec des protéines de fusion avidine monomère et que cette liaison à la surface du BCG est stable et reproductible sans changement détectable à la survie et la croissance bactérienne. En outre, nous avons constaté que BCG orné de monomère avidine fusionnée avec des ovules (AviOVA) peut induire une réponse immunitaire semblable à celle induite par le BCG génétiquement exprimant l’antigène même in vitro et in vivo. Cette technologie d’affichage réversible de protéines d’intérêt sur la surface bactérienne est donc un remplacement efficace des approches de transfert de gène traditionnel et peut fournir une plate-forme pour les grandes manipulations du BCG et de nouvelles demandes en vaccin développement.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 StemCell Technologies sans endotoxines</td><td>&nbsp ;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotine</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>Streptavaridine conjuguée à la FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>I-Ab-OVA323-339 tétramère&nbsp ;</td><td>MBL International&nbsp ;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON polyhistidine-Tag résine de purification&nbsp ;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 rat conjugué anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 anti-souris IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 anti-souris RAT I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 rat anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE rat anti-souris CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 anti-souris H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin conjugué FITC</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Chèvre ultra-petite conjuguée à l’or anti-lapin</td><td>Microscopie électronique IgG Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 bouillon</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Lignées cellulaires de macrophages murins</td><td>Type américain Culture Collection</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 plasmide&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pUC57-OVA&nbsp ;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonase&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp ;</td><td>Plasmide Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 Colonnes</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA†nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateurs de protéines Pierce&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II microscope à épifluorescence</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique CCD&nbsp ;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 Microscope électronique 200kV&nbsp ;</td><td>FEI Entreprise</td><td>G2 200Kv&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu ; m Passoire à cellules Falcon&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Souris EasyStep kit de sélection positive à la biotine&nbsp ;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotine-Ter119/Ertyroid cells anticorps</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm kit&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase sey system</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminometer&nbsp ;</td><td>Microtome Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6</td><td>&nbsp ; Lyophilisateur Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp ;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton flacons en verre boroscilicate</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp ; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

expression des antigènes exogènes dans le mycobacterium bovis bcg par l’intermédiaire de décoration de surface non génétiques avec le système avidine-biotine

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

La tuberculose est une maladie infectieuse grave et le bacille de M. bovis de vaccin disponible uniquement Calmette-Guérin (BCG) est sûr et efficace pour la protection contre la méningite tuberculeuse grave de l’enfant et de certaines formes de tuberculose disséminée, mais ne parvient pas à protéger contre la tuberculose pulmonaire, qui est la forme la plus répandue de la maladie. Des stratégies prometteuses pour améliorer le BCG actuellement fonder soit sur sa transformation avec gènes codant immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-antigènes spécifiques et/ou de complémentation avec des gènes codant des co-facteurs qui stimuleraient l’antigène cellules présentatrices. Les principales limites de ces approches incluent faible efficacité et faible stabilité au niveau incertain de sûreté des vecteurs d’expression. Dans cette étude, nous présentons une approche alternative à l’amélioration de vaccin, qui se compose de complémentation de BCG avec des protéines exogènes d’intérêt sur la surface des bactéries, plutôt que de transformation avec des plasmides codant des gènes correspondants. Tout d’abord, les protéines d’intérêt sont exprimées en fusion avec avidine monomère dans la norme d’e. coli des systèmes d’expression, puis utilisée pour décorer la surface de biotinylé BCG. L’expérimentation animale utilisant BCG surface ornée d’antigène de l’ovalbumine substitut démontre que la bactérie modifiée est immunogène et capables d’induire des lymphocytes T spécifiques. Au total, les données présentées ici fortement appuient un roman et une méthode efficace pour remodeler le vaccin BCG actuel qui remplace l’approche conventionnelle laborieux de complémentation avec des acides nucléiques exogènes.

Les procédures générales décrites ci-dessus, la faisabilité de BCG biotinylation surface et décoration avec l’antigène ovules de la mère porteuse a été examinée. L’immunogénicité de la BCG modifié a ensuite été testé in vivo. La surface bactérienne a été facilement étiquetée avec la biotine pour affichage rapide d’antigènes chimérique avidine sans modification décelable dans les phénotypes bactériennes. Le BCG modifié qui en résulte est efficacement ingéré par les cellules de pré...

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer des protéines de surface sur des mycobactéries en utilisant la décoration de surface avec des protéines recombinantes comme alternative aux approches traditionnelles basées sur la génétique. Ces méthodes peuvent aider à répondre à d’importantes questions de recherche dans le domaine de la mycobactériologie, en particulier dans le domaine des interactions hospitalières et du développement de vaccins. Cette technique peut être utilisée pour dépister les facteurs d’interférence potentiels ou les candidats antigènes.Il peut être le et rapidement comparé aux approches génétiques traditionnelles fastidieuses et chronophages. Amina Talal, assistante de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Cette partie du protocole commence par la transformation du plasmide P17 Aviden OVA en E.Coli BL21.Pour ce faire, induisez 250 millilitres de culture d’E.Coli BL21 avec IPTG pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Après trois heures, lysons les bactéries pour solubiliser les corps d’inclusion en granulant d’abord la culture BL21 induite et en jetant le surnageant. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon de lyse et laissez les cellules être lysées pendant 15 minutes.Poursuivez ensuite l’incubation à température ambiante à l’aide d’un rotateur pour agiter et laissez-le aller toute la nuit. Le matin, centrifugez le mélange pendant une demi-heure. Prélever ensuite le surnageant contenant les corps d’inclusion solubilisés.Ensuite, purifiez les protéines OVA d’Aviden à l’aide d’une colonne de nickel NTA. Tout d’abord, diluez le surnageant un à deux dans un tampon de lyse et estimez le volume. Préparez ensuite une colonne contenant quatre millilitres de résine de nickel NTA pour 250 millilitres de surnageant dilué et chargez la dilution sur la colonne.Ensuite, lavez la colonne trois fois à l’aide de 10 millilitres de tampon de lyse à pH sept par lavage. Pour recueillir la protéine recombinante, laver la colonne avec un tampon de lyse contenant de l’imidazole et recueillir l’éluat. Si votre protéine recombinante est exempte de corps d’inclusion, la procédure suivante sera bénéfique pour de nombreuses protéines dans notre laboratoire.Tout d’abord, ajustez le pH de la solution de repliement pour qu’il soit d’une unité au-dessus ou en dessous du point isoélectrique de la protéine. Ensuite, vortex progressivement et diluez la protéine à une dilution de 1 à 10 dans une solution de repliement. Ensuite, incubez la protéine sur un agitateur magnétique pendant 30 minutes à température ambiante pour terminer le processus de repliement.Ensuite, le dessalage et le tampon échangent les protéines repliées en PBS à l’aide d’un concentrateur de protéines. Poursuivez en centrifugeant la colonne et stockez les aloquats de protéines solubles à 20 degrés Celsius. Travailler dans une enceinte de biosécurité à l’aide d’un équipement de protection individuelle, car le BCG est un agent pathogène de niveau 2.Pour biotinyler la surface des cellules BCG, cultivez d’abord les cellules sur une plate-forme de shaker à la bonne densité. Prélevez environ un milliard de cellules et lavez-les trois fois à l’aide de 500 microlitres de PBST glacé et sans endotoxines. Ensuite, faites tourner les cellules et suspendez-les dans du PBS stérile et sans endotoxines.Ensuite, préparez de la biotine sulfo-NHSSS fraîche de 10 millimolaires dans de l’eau filtrée stérile. Ensuite, incubez les bactéries dans un millilitre de bouillon contenant 0,5 millimolaire de biotine sulfo-NHSSS. Effectuez l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, lavez trois fois les bactéries maintenant étiquetées avec 500 microlitres de PBST glacé, comme précédemment pour éliminer le réactif qui n’a pas réagi. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBST. Pour évaluer l’efficacité de la biotinylation, colorez un aloquat de 100 millions de BCG biotinylé avec 25 microlitres de Strepravidin-FITC.Ensuite, incubez brièvement les bactéries colorées dans du para-formaldéhyde, puis mesurez le niveau de biotinylation à l’aide de la cytométrie en flux. Après avoir évalué la croissance et la survie des mycobactéries biotinylées, procédez à la liaison de la protéine de fusion Aviden à celles-ci. Tout d’abord, mélangez 500 millions de BCG biotinylés avec la protéine de fusion Aviden pour une concentration finale de 10 microgrammes de protéines par millilitre.Laissez cette réaction se dérouler pendant une heure à température ambiante sur un shaker. Ensuite, lavez les bactéries trois fois avec 500 microlitres de PBST glacé. Colorez ensuite les bactéries avec un anticorps anti-Aviden de lapin pendant 20 minutes à température ambiante.Après 20 minutes, effectuez une étape de lavage avec 500 microlitres de PBST glacé. Ensuite, colorez la bactérie avec l’anticorps IGG anti-lapin de chèvre conjugué à la FITC. Ensuite, lavez les bactéries à l’aide de 500 microlitres de PBST glacé et analysez les bactéries par cytométrie en flux pour évaluer la décoration de la surface.Après avoir suivi le protocole décrit, la cytologie montre qu’il y avait des niveaux minimes de liaison de l’OVA aux bactéries non biotinylées et des niveaux significatifs de liaison de l’OVA aux bactéries biotinylées. Il est important de noter que les niveaux d’Aviden OVA à la surface bactérienne sont restés stables et détectables un mois après la lyophilisation et le stockage à température ambiante. Ensuite, des cellules RAW et des bactéries dsRed ont été utilisées pour effectuer un test de phagocytose.Heureusement, il n’y avait pas de dissuasion dans le phénotype des macrophages. Pour examiner le devenir des BCG décorés d’Aviden OVA dans les macrophages, les cellules RAW adhérentes ont été infectées et examinées par microscopie à fluorescence. Aviden OVA n’était pas seulement présent à la surface de la bactérie, mais également détaché et translocalisé dans le cytoplasme loin de la bactérie.Une expérience de coloration immuno-or a montré que les antigènes OVA d’Aviden peuvent se détacher de la surface du BCG, traverser la membrane phagosomale et se déplacer vers le cytosol. Les macrophages infectés par Aviden OVA BCG ont montré une co-localisation d’Avi OVA avec des molécules IA. Cela suggère que les protéines de fusion Aviden se détachent et se déplacent dans les compartiments de présentation de l’antigène pour être chargées sur les molécules du CMH2.Les peptides OVA d’Aviden sont également co-localisés avec des molécules de classe I dans les phagosomes du BCG, comme le montre la coloration H2K. Ainsi, il existe une présentation potentielle de l’antigène Avi OVA aux lymphocytes T CD8 positifs par le macrophage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer les protéines chez les mycobactéries, et cet organisme est difficile à manipuler avec les méthodes génétiques actuelles.Après la technique, nous l’utilisons avec succès pour charger le vaccin avec l’antigène de la mycobactérie est à six. Ensuite, nous avons montré que les vaccins modifiés étaient susceptibles d’être utilisés comme réponse immunitaire spécifique dans le modèle murin. Nous collaborons actuellement avec nous pour explorer cette approche dans la tératine Nous avons proposé d’utiliser le BCG amélioré avec des antigènes ou des immunobulateurs sélectionnés.

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Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

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Nous détaillons ici la méthodologie suivie pour comparer l’efficacité protectrice et la réponse immunitaire pulmonaire induites par l’immunisation intranasale et sous-cutanée avec le BCG dans un modèle murin. Nos résultats montrent les avantages de la vaccination pulmonaire et suggèrent un rôle de la réponse médiée par l’IL17 dans la protection induite par le vaccin.

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Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

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Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

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Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

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Découvrez une méthode de décoration de surface non génétique pour exprimer des antigènes exogènes sur Mycobacterium bovis BCG via le système avidine-biotine. Cette technique rapide améliore l'immunogénicité pour le développement vaccinal.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine (Vidéo) | JoVE Journal

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

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