Name: Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Découvrez une méthode de décoration de surface non génétique pour exprimer des antigènes exogènes sur Mycobacterium bovis BCG via le système avidine-biotine. Cette technique rapide améliore l'immunogénicité pour le développement vaccinal.

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Nous remercions le Dr R Stokes pour la souche de BCG Pasteur et A. Talal pour le support technique. Nous remercions également GenScript pour aide à la synthèse de gènes.

Tous les animaux ont été maintenues conformément aux protocoles approuvés par les comités de l’emploi à l’Université de la Colombie-Britannique et animalier. Expériences ont été approuvés par les comités de l’utilisation et de protection des animaux et interprétés selon le Canadian Council on Animal Care lignes directrices. Le nombre de bien-être des animaux assurance est A11-0247.
1. génération des protéines de Fusion de monomère avidine exprimant des plasmides
<ol><li>Cloner l’avidine monomère séquence12 dans le plasmide pDEST17 entre les sites « CCT » et « GAA » qui correspond à 133-134bp. (c'est-à-direentre la 6-histag et le site de recombinaison Attr1 pDEST17) pour obtenir p17-Avi. Remarque : La séquence d’ADN de monomère avidine est illustrée ci-dessous. Les trois mutations introduites en avidine sauvage pour obtenir l’avidine monomère sont indiquées en caractères gras. gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc STCATCatga ccatcggggc tgtgaacagc agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac ACAAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga</li>
	<li>Concevoir des amorces flanqués de sites AttB1 et B2 Attcorrespondant aux ovules polypeptide757-1035 (I-Ab- et H-2_Kb-restreint des épitopes) séquence d’ADN. Séquences d’amorces sont : Attb1-OVA B2-OVA TCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTgirot et Att GIROTACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 et b2 des Attséquences figurent en caractères gras).<ol>
<li>PCR-amplifier OVA757-1035 ADN séquence polypeptidique avec les amorces ci-dessus en utilisant le plasmide pUC57-OVA comme gabarit.</li>
		<li>Cloner les produits PCR dans pDONR-221 à travers une in situ in vitro réaction de recombinaison (p. ex., Clonase BP) pour obtenir des pDONR-OVA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer le gène d’intérêt dans p17-Avi à l’aide de la réaction Clonase LR pour obtenir p17-Avi-OVA. Remarque : Pour plus de détails de clonage de recombinaison BP et LR, voir le manuel du constructeur.</li>
</ol>2. monomère avidine Fusion Protein Expression, Purification et repliement
<ol><li>Transformer le plasmide p17-Avi-OVA en e. coli BL21 et induire de 250 mL d’e. coli BL21 culture avec IPTG (0,1 M) pendant 3 h à 37 ° C.</li>
	<li>
Lyse des bactéries et la solubilisation des corps d’Inclusion
	<ol>
<li>Granule le 250 mL de la culture BL21 induite par 30 min de centrifugation à 4 000 x g et 4 ° C.</li>
		<li>Recueillir des granulés dans 10 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 Guanidine-HCL, pH 1,5 à 2,5 M) et incuber pendant 15 minutes à 95 ° C. Incuber une nuit à température ambiante sur un agitateur.</li>
		<li>Centrifuger 30 min à 15 000 x g et 4 ° C et à frais viré surnageant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purifier Avi-OVA de surnageant (Fraction solubilisée corps d’Inclusion) à l’aide de colonnes Ni-NTA.
	<ol>
<li>Diluer les corps d’inclusion 1:2 avec tampon de lyse.</li>
		<li>Utilisez 4 mL de résine Ni-NTA par 250 mL de corps d’inclusion dérivées de la culture.</li>
		<li>Laver 3 x 10 ml de tampon de lyse (pH 7,0).</li>
		<li>Éluer avec 10 mL de tampon d’élution (lyse tampon pH 7.0 avec imidazole 250 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replier la protéine éluée par dilution progressive (01:10) et une agitation rapide dans un tampon Tris (pH 7.5) contenant 1 millimètre DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM Tween 80, arginine 500 mM et 200 mM NaCl pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Hors sel et échange tampon replié protéine de tampon Tris dans PBS avec concentrateurs de protéines selon les protocoles du fabricant.</li>
	<li>Supprimer des agrégats par centrifugation pendant 30 min à 3 500 g x et à 4 ° C et stocker les aliquotes de protéine soluble à-20 ° C.</li>
</ol>3. Biotinylation de Surface cellulaire de BCG
<ol><li>Croître BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min jusqu'à OD = 0,5-1. Remarque : Le BCG est un pathogène de niveau 2 de biosafety et toutes les expériences concernant le BCG devraient être faites dans une armoire avec un équipement de protection personnels de biosécurité.</li>
	<li>Lavez 109 BCG 3 fois avec 500 µL de PBS gratuit endotoxine glacee plus 0,1 % Tween80 (PBST) (pH 8,0). Suspendre pastille de BCG dans du PBS gratuit endotoxine stérile.</li>
	<li>
Immédiatement avant l’emploi, préparer 1 mL de biotine Sulfo-NHS SS 10 mM dans l’eau filtrée stérile.
	<ol>
<li>Incuber les bactéries avec 1 mL de 0,5 mM de biotine Sulfo-NHS SS à température ambiante pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laver les bactéries marqués 3 fois avec 500 µL de glacé PBST froid pour enlever non-réagi biotinylation réactif.
	<ol>
<li>Resuspendre le culot dans 1 mL de PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluer l’efficacité biotinylation, tache 108 biotinylé BCG avec streptavidine-FITC (au 1/100, 25 µL) à température ambiante pendant 20 min.
	<ol>
<li>Incuber les bactéries colorées dans 1 mL de 2 % PFA pendant 20 min à température ambiante et ensuite examiner les niveaux de biotinylation par analyse en cytométrie en flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. phénotype des mycobactéries biotinylés : croissance et survie
<ol><li>
Croissance des souches de BCG en bouillon Middlebrook 7H 9 bouillon avec 10 % OADC (acide oléique, solution d’albumine et dextrose) et 0,05 % de Tween 80 à 37 ° C sur une plateforme de shaker à 50 tr/min.
	<ol>
<li>Enregistre la densité optique (OD600) de la culture bactérienne pendant une période de 8 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilisez le BCG-Luc (décrite précédemment9) pour détecter la survie des bactéries dans les macrophages.
	<ol>
<li>Infecter les cellules RAW264.7 avec biotinylé BCG-Luc (MOI 10:1) ou non traitées par le BCG-Luc (contrôle) et incubé à 37 ° C sur un 48 h de délai.</li>
		<li>Laver les monocouches de cellules et puis lyse avec 0.025 % SDS pour libérer des bactéries ingérées.</li>
		<li>Mesurer la production de bioluminescence avec système de dosage de luciférase et luminomètre. NOTE : Signal de Luminescence est révélatrice de la viabilité bactérienne. Veuillez consulter le manuel du fabricant pour plus de détails de l’analyse de luciferase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. la liaison de la protéine avidine-Fusion monomère à Surface de BCG biotinylés
<ol><li>Mélanger 5 x 108 biotinylé BCG avec Avi-protéine (10 μg/mL final PBS-T) pendant 1 h à température ambiante sur la plate-forme agitatrice.</li>
	<li>Bactéries de laver 3 fois avec 500 µL de PBST froid glacé et tache avec anticorps de lapin anti-avidine (Ab) (dilution 1 : 100, décrites précédemment10) pendant 20 min à température ambiante, puis à la FITC conjuguent anti-lapin de chèvre Ab IgG dans les mêmes conditions.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 500 µL de PBST, les bactéries et d’analyser par cytométrie de flux pour évaluer l’ampleur de la décoration de surfaces.</li>
</ol>6. la lyophilisation des mycobactéries
<ol><li>Biotinylater bactéries selon l’étape 3.1 à 3.4 et manteau biotinylé bactéries avec Avi-OVA selon étape 5.1.</li>
	<li>Aliquote biotinylé et enduits bactéries (108), laver avec du PBS et remettre en suspension dans 0,5 mL de milieu de lyophilisation (1,5 % milieu de Sauton de 25 % et 75 % H2O Na-glutamate).</li>
	<li>Transférer des bactéries de flacons en verre et congeler dans un congélateur à-80 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Lyophiliser les flacons en verre remplis et congelés pendant 24 h à l’aide d’un gel du séchoir.</li>
	<li>Stocker les échantillons séchés à température ambiante et reconstituer dans du PBS quand nécessaire.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.5 pour évaluer la biotinylation et stabilité de revêtement de surface.</li>
</ol>7. phagocytose Assay
<ol><li>Grandir 264.7 cellules macrophages dans les récipients de culture de diamètre de 10 cm en DMEM moyen contenant 5 % FCS, 1 % de L-glutamine, HEPES, acides aminés non essentiels et la pénicilline et la streptomycine jusqu'à la confluence de 70 à 80 %.</li>
	<li>2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages dans une plaque 6 puits de graines. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Générer la DsRed BCG (décrite précédemment9) décoré avec Avi-OVA (DsRed BCG-Avi-OVA) selon les étapes 3.1 à 3.4 et 5.1.</li>
	<li>Infecter les cellules RAW avec DsRed BCG-Avi-OVA ou non traitée DsRed BCG à MOI 20:1 pendant 24 h à 37 ° C.</li>
	<li>Laver trois fois les cellules et trypsinize en utilisant 1 mL de 0,25 % de trypsine à 37 ° C pendant 10 min pour éliminer les bactéries partiellement détachées.</li>
	<li>Difficulté à 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois avec du PBS et d’analyser par cytométrie en flux.</li>
</ol>8. intracellulaire d’oeufs décorés biotinylé BCG dans les Macrophages
<ol><li>
Microscopie en fluorescence
	<ol>
<li>Graines de 3 x 105 RAW 264.7 cellules de macrophages sur les lamelles dans une assiette de 24 puits. Permettre aux cellules d’adhérer une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Infecter les cellules macrophages avec mycobactéries (MOI 10:1) dans les médias de maintenance sans antibiotiques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 4 à 24 h.</li>
		<li>Laver les cellules et trypsinize pour supprimer la surfaces bactéries non ingéré, attachés comme à l’étape 7,5.</li>
		<li>Cellules Fix infecté dans 2,5 % PFA dans du PBS pendant 20 min à température ambiante suivi par 3 lavages avec du PBS.</li>
		<li>Permeabilize des cellules dans un tampon bloquant/perméabilisation (0,1 % X-100 Triton, 3 % de BSA dans du PBS) pendant 20 min à température ambiante.<ol>
<li>Anticorps spécifiques d’utilisation d’intérêt (p. ex., lapin anti-avidine Ab) à 10 μg/mL en perméabilisation tampon pendant 20 min à température ambiante suivi d’anticorps secondaire (p. ex., IgG anti-lapin FITC-chèvre) pendant 20 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laver les cellules 3 fois avec du PBS, une fois avec de l’eau monter sur diapositives de 10 μl de milieu de montage aqueux pour réduire au minimum le photoblanchiment de fluorescence.</li>
		<li>Examiner les diapositives de la microscopie confocale numérique à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé x 63 / 1.4 objectif Plan-Apochromat. Enregistrer des images à l’aide d’un appareil photo numérique couplé au logiciel de microscope.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La coloration immunologique à l’or et la microscopie électronique
	<ol>
<li>Graines de 2 x 106 RAW 264.7 cellules de macrophages en plaques 6 puits.</li>
		<li>Difficulté des macrophages infecté par le BCG avec 4 % PFA pendant 4 h à température ambiante.</li>
		<li>Échantillons de laver deux fois avec du PBS.</li>
		<li>Intégrer des échantillons dans l’agarose de bas point de fusion de 4 % et déshydrater dans l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Transfert des échantillons de résine acrylique et polymériser à 50 ° C.</li>
		<li>Découper 60 sections nm avec un microtome et recueillir des sections sur les grilles de nickel.</li>
		<li>Étiqueter les échantillons avec 10 μg/mL d’anticorps avidine pendant 1 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit dans une solution d’incubation (BSA PBS et 0,1 %) et laver ensuite avec incubation solution conjugué or f2 ultra petite chèvre-anti-lapin IgG (1/20) pendant 1 h à la salle température dans la solution d’incubation.</li>
		<li>Laver les sections dans l’eau distillée, tache au glutaraldéhyde à 2 %, laver, sécher à l’air, puis examinez au microscope électronique à.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. animale vaccination et traitement de l’orgue
Remarque : Toutes les mesures devraient être prises dans une armoire de sécurité biologique.
<ol><li>Col biotinylé et protéine enduit bactéries à travers 271/2G aiguille 10 fois de faire suspension monocellulaire.</li>
	<li>
Prendre 1 x 106 bactéries dans 100 μl de PBS exempte d’endotoxine et immuniser une souris C57BL/6 femelles (I-A,b, H - 2 Kb, vieux de 5 à 6 semaines) par voie sous-cutanée dans la peau du cou.
	<ol>
<li>Injecter des souris témoins avec 100 μl de PBS seul.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Euthanasier souris immunisées 20 jours après la vaccination par inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale.
	<ol>
<li>Isoler la rate et transférez-le dans milieu RPMI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purée de rate à travers un tamis de cellule de 70 µm avec un piston de seringue de 5 mL.
	<ol>
<li>Laver avec 5 mL de RPMI. Centrifugeuse (800 x g, 3 min) pour isoler une suspension monocellulaire.</li>
		<li>Appauvrissent la RBC avec kit de sélection positive de biotine de souris avec des cellules érythroïdes-Ter119/biotine Ab.</li>
		<li>Centrifuger et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de RPMI complet (FCS de 10 %, 1 % L-glutamine, pénicilline 1 %, 1 % streptomycine et 50 μM 2-ME).</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. I-Ab tétramère de coloration pour déterminer les fréquences de spécifiques à l’antigène CD4+ des cellules T et intracellulaire Cytokine coloration pour déterminer des fréquences de spécifiques à l’antigène T cellules libérant Cytokines chez les animaux vaccinés
<ol><li>
Tétramère coloration
	<ol>
<li>Tache de splénocytes de contrôle et de la souris immunisées (~ 20 x 106 cellules) avec conjugué PE I-Ab-tétramères de323-339 OVA (dilution 1/12,5) pendant 1 h à 37 ° C dans le tampon de liaison (PBS avec FCS 2 % et 0,1 % NaN3).</li>
		<li>Ajouter AF647 CD4 Ab (01:25) et 7-AAD (pour détecter les cellules mortes) de splénocytes pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Analyser des échantillons par cytométrie en flux.</li>
		<li>Acquérir 500 000 événements dans la région de CD4 positif afin de déterminer la fréquence d’événements positifs tétramère. NOTE : Total splénocytes sont définies par la tache de dot SSC/FSC, des cellules vivantes par l’exclusion des événements positifs 7-AAD, ainsi que ses sous-ensembles CD4 par le déclenchement des événements positifs AF647.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fréquence de l’antigène spécifique Intracellular Cytokine libérant des lymphocytes T
	<ol>
<li>Transfert environ 1 × 107 splénocytes dans 4 mL de milieu RPMI complet en six plats avec ou sans ovules recombinantes (10 µg/mL) et incuber pendant 16 h.</li>
		<li>Traiter les cellules avec la bréfeldine A (1:1, 000) pendant 5 h supplémentaires.</li>
		<li>Laver avec du PBS et sous réserve de la cytokine intracellulaire coloration comme suit :<ol>
<li>Une coloration des échantillons de cellules avec PE-CD8 ou PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 dans le tampon de liaison) à température ambiante pendant 30 min.</li>
			<li>Difficulté à 4 % PFA à température ambiante pendant 20 min.</li>
			<li>Permeabilize à l’aide de la solution de la perméabilisation, selon les instructions du fabricant.</li>
			<li>Laver les cellules et étiquette avec conjugué AF647 IFN-γ Ab (01:50) pendant 20 min à température ambiante.</li>
			<li>Laver les cellules et soumis à l’analyse en cytométrie en flux, comme décrit ci-dessus.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons rapporté dans cette étude une approche non génétiques pour un affichage rapide et efficace des protéines exogènes sur surface de BCG pour ajouter des antigènes spécifiques ou des propriétés fonctionnelles spécifiques censées améliorer efficacement l’immunogénicité de la bactérie. Nous avons démontré que la surface des cellules BCG pourrait être facilement biotinylé pour la décoration de surface instantanée avec des protéines de fusion de l’avidine. La procédure totale peut être effectuée dans les 2 h, tandis q...

Diverses stratégies ont été proposées pour remplacer l’actuel TB vaccin BCG, y compris les protéines adjuvant systèmes, technologies vectorisées virales, souches vivantes atténuées de tuberculosis et des souches de BCG génétiquement modifiées, soit pour introduire des gènes surexprimant les antigènes BCG qui ne sont pas suffisamment exprimées au cours de l’infection1 ou VTT-antigènes spécifiques non présent dans le BCG2. Génie génétique, cependant, est confrontée à de nombreux obstacles y compris le niveau incertain de la sécurité, le processus fastidieux et la faible efficacité de vecteurs d’expression,4,5. En ce qui concerne l’amélioration de BCG, une autre approche est nécessaire pour améliorer l’immunogénicité sans la nécessité d’alternances génétiques incertains.
Dans cette étude, nous introduisons une nouvelle stratégie pour l’affichage des protéines recombinantes d’intérêt sur la surface des cellules par le BCG qui repose sur l’interaction de l’avidine bien connue de haute affinité avec de la biotine. Cette approche permet une fixation rapide et reproductible des protéines de fusion recombinantes avidine sur la surface de biotinylé BCG, ce qui facilite les manipulations larges de BCG à réaliser une amélioration maximale de son efficacité tout en conservant son excellente sécurité enregistrer, observé au cours des décennies d’utilisation.
L’avidine affinité pour la biotine est extrêmement élevée (Kd = 10−15 M) et une fois formé, le complexe biotine-avidine est très stable et peut seulement être perturbé sous dénaturer des conditions6. Toutefois, pour ce type d’interaction pour servir comme une alternative de méthode de transfert de gène, affichage à long terme mais réversible de protéines recombinantes est requise. Ainsi, nous avons introduit ici une avidine monomère de faible affinité (Kd = 10−7 M) que mène à la libération réversible de protéines de la surface décorée BCG ingéré une fois à l’intérieur de cellules présentatrices. Afin de fournir une preuve de concept, nous avons testé cette méthode en utilisant une protéine chimérique avidine monomère correspondant à un antigène de substitution provenant d’ovalbumine (OVA)7,8. Les résultats ont montré que la surface des cellules par le BCG peut être facilement et rapidement décorée avec des protéines de fusion avidine monomère et que cette liaison à la surface du BCG est stable et reproductible sans changement détectable à la survie et la croissance bactérienne. En outre, nous avons constaté que BCG orné de monomère avidine fusionnée avec des ovules (AviOVA) peut induire une réponse immunitaire semblable à celle induite par le BCG génétiquement exprimant l’antigène même in vitro et in vivo. Cette technologie d’affichage réversible de protéines d’intérêt sur la surface bactérienne est donc un remplacement efficace des approches de transfert de gène traditionnel et peut fournir une plate-forme pour les grandes manipulations du BCG et de nouvelles demandes en vaccin développement.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 StemCell Technologies sans endotoxines</td><td>&nbsp ;</td><td>36750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS SS biotine</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>21328</td><td></td></tr><tr><td>Streptavaridine conjuguée à la FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3762</td><td></td></tr><tr><td>I-Ab-OVA323-339 tétramère&nbsp ;</td><td>MBL International&nbsp ;</td><td>TS-M710-1</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>TALON polyhistidine-Tag résine de purification&nbsp ;</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor (AF) 647 rat conjugué anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>AF647 anti-souris IFN-g</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557735</tr><tr><td>AF647 anti-souris RAT I-A/I-E</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>562367</tr><tr><td>PeCy7 rat anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>552775</tr><tr><td>PE rat anti-souris CD8 Ab</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>561095</tr><tr><td>AF 647 anti-souris H-2kb</td><td>BD Bioscience</td><td>562832</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin conjugué FITC</td><td>Thermo Fisher</td><td>31635</td><td></td></tr><tr><td>AF 647 anti-souris CD4</td><td>BD Bioscience&nbsp ;</td><td></td><td></td>557681</tr><tr><td>Chèvre ultra-petite conjuguée à l’or anti-lapin</td><td>Microscopie électronique IgG Sciences</td><td>25100</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 bouillon</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>B11886</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 Lignées cellulaires de macrophages murins</td><td>Type américain Culture Collection</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDEST17 plasmide&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11803012</td><td></td></tr><tr><td>plasmide pUC57-OVA&nbsp ;</td><td>GenScript</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>BP clonase&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>LR clonase&nbsp ;</td><td>Plasmide Invitrogen</td><td>11791043</td><td></td></tr><tr><td>pDONR221 Colonnes</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA†nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateurs de protéines Pierce&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>88527</td><td></td></tr><tr><td>Flurosave</td><td>Calbiochem-Novabiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan II microscope à épifluorescence</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique CCD&nbsp ;</td><td>Retiga EX, QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 Microscope électronique 200kV&nbsp ;</td><td>FEI Entreprise</td><td>G2 200Kv&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>70&mu ; m Passoire à cellules Falcon&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>87712</td><td></td></tr><tr><td>Souris EasyStep kit de sélection positive à la biotine&nbsp ;</td><td>StemCell</td><td>18556</td><td></td></tr><tr><td>biotine-Ter119/Ertyroid cells anticorps</td><td>BioLegend</td><td>116203</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Pharmingen</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm kit&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase sey system</td><td>Promega</td><td>e2620</td><td></td></tr><tr><td>Turner Biosystem luminometer&nbsp ;</td><td>Microtome Promega</td><td>TD-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM UC6</td><td>&nbsp ; Lyophilisateur Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Novalyphe NL 500</td><td>Savant Instruments</td><td>&nbsp ;NL 50</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton flacons en verre boroscilicate</td><td>Wheaton</td><td>&nbsp ; VWR 66011-675</td><td></td></tr></tbody></table>

expression des antigènes exogènes dans le mycobacterium bovis bcg par l’intermédiaire de décoration de surface non génétiques avec le système avidine-biotine

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

La tuberculose est une maladie infectieuse grave et le bacille de M. bovis de vaccin disponible uniquement Calmette-Guérin (BCG) est sûr et efficace pour la protection contre la méningite tuberculeuse grave de l’enfant et de certaines formes de tuberculose disséminée, mais ne parvient pas à protéger contre la tuberculose pulmonaire, qui est la forme la plus répandue de la maladie. Des stratégies prometteuses pour améliorer le BCG actuellement fonder soit sur sa transformation avec gènes codant immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-antigènes spécifiques et/ou de complémentation avec des gènes codant des co-facteurs qui stimuleraient l’antigène cellules présentatrices. Les principales limites de ces approches incluent faible efficacité et faible stabilité au niveau incertain de sûreté des vecteurs d’expression. Dans cette étude, nous présentons une approche alternative à l’amélioration de vaccin, qui se compose de complémentation de BCG avec des protéines exogènes d’intérêt sur la surface des bactéries, plutôt que de transformation avec des plasmides codant des gènes correspondants. Tout d’abord, les protéines d’intérêt sont exprimées en fusion avec avidine monomère dans la norme d’e. coli des systèmes d’expression, puis utilisée pour décorer la surface de biotinylé BCG. L’expérimentation animale utilisant BCG surface ornée d’antigène de l’ovalbumine substitut démontre que la bactérie modifiée est immunogène et capables d’induire des lymphocytes T spécifiques. Au total, les données présentées ici fortement appuient un roman et une méthode efficace pour remodeler le vaccin BCG actuel qui remplace l’approche conventionnelle laborieux de complémentation avec des acides nucléiques exogènes.

Les procédures générales décrites ci-dessus, la faisabilité de BCG biotinylation surface et décoration avec l’antigène ovules de la mère porteuse a été examinée. L’immunogénicité de la BCG modifié a ensuite été testé in vivo. La surface bactérienne a été facilement étiquetée avec la biotine pour affichage rapide d’antigènes chimérique avidine sans modification décelable dans les phénotypes bactériennes. Le BCG modifié qui en résulte est efficacement ingéré par les cellules de pré...

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer des protéines de surface sur des mycobactéries en utilisant la décoration de surface avec des protéines recombinantes comme alternative aux approches traditionnelles basées sur la génétique. Ces méthodes peuvent aider à répondre à d’importantes questions de recherche dans le domaine de la mycobactériologie, en particulier dans le domaine des interactions hospitalières et du développement de vaccins. Cette technique peut être utilisée pour dépister les facteurs d’interférence potentiels ou les candidats antigènes.Il peut être le et rapidement comparé aux approches génétiques traditionnelles fastidieuses et chronophages. Amina Talal, assistante de recherche dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Cette partie du protocole commence par la transformation du plasmide P17 Aviden OVA en E.Coli BL21.Pour ce faire, induisez 250 millilitres de culture d’E.Coli BL21 avec IPTG pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Après trois heures, lysons les bactéries pour solubiliser les corps d’inclusion en granulant d’abord la culture BL21 induite et en jetant le surnageant. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 10

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des...

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Cette vidéo démontre l’induction d’une inflammation systémique chez une souris anesthésiée. L’injection de dépôts adjuvants d’antigènes mycobactériens déclenche la libération de cytokines et une inflammation localisée. Les vaisseaux lymphatiques s’ouvrent, ce qui permet l’entrée des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques et l’activation des lymphocytes T, qui libèrent des cytokines pro-inflammatoires, entraînant une inflammation généralisée.

Injection sous-cutanée d’un antigène bactérien pour induire une inflammation systémique dans un modèle murin

Cette vidéo montre la préparation et la quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux à l’aide d’un test de bioluminescence et du dénombrement des unités formant des colonies. L’inoculum préparé peut être utilisé pour les études d’infection.

Préparation et quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis BCG lux pour l’infection

Cette vidéo présente une méthode permettant de générer des vaccins multivalents à vésicules de membrane externe (OMV). Des cellules de mammifères sont transfectées pour exprimer et sécréter des antigènes viraux fusionnés à un SpyTag et à un marqueur de polyhistidine. Ces antigènes sont ensuite purifiés à l’aide d’une colonne d’affinité d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA). L’antigène purifié est mélangé à des vésicules de membrane externe exprimant la protéine SpyCatcher (SC) liée à la...

Génération d’un vaccin multivalent à vésicules de la membrane externe

La vidéo montre une technique de chargement d’antigènes sur Mycobacterium bovis BCG pour améliorer ses propriétés immunogènes. La méthode utilise le système avidine-biotine pour recouvrir la surface bactérienne d’antigènes exogènes.

Technique de conjugaison avidine-biotine pour présenter des antigènes cibles sur Mycobacterium bovis BCG

L'interféron γ cultivées dosage immuno-enzymatique à long terme est utilisée comme mesure de réponses de la mémoire centrale et est en corrélation avec les réponses des vaccins anti-mycobactériens protection. Avec cet essai, des cellules mononucléaires du sang périphérique sont stimulés avec des antigènes mycobactériens et l'interleukine-2 pendant 14 jours, permettant la différenciation et l'expansion de lymphocytes T mémoire centrale.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Nous détaillons ici la méthodologie suivie pour comparer l’efficacité protectrice et la réponse immunitaire pulmonaire induites par l’immunisation intranasale et sous-cutanée avec le BCG dans un modèle murin. Nos résultats montrent les avantages de la vaccination pulmonaire et suggèrent un rôle de la réponse médiée par l’IL17 dans la protection induite par le vaccin.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Une plate-forme vaccinale à nanoparticules « plug-and-display » basée sur des vésicules de membrane externe présentant un domaine de liaison au récepteur du SRAS-CoV-2

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Ici, nous présentons un protocole alternatif pour induire activement l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale chez les souris C57BL / 6, en utilisant l’épitope immunogène myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 en suspension dans l’adjuvant de Freund incomplet contenant la sous-espèce paratuberculose de Mycobacterium avium tuée par la chaleur.

Activité adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis dans l’amélioration de l’immunogénicité des autoantigènes au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Découvrez une méthode de décoration de surface non génétique pour exprimer des antigènes exogènes sur Mycobacterium bovis BCG via le système avidine-biotine. Cette technique rapide améliore l'immunogénicité pour le développement vaccinal.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine (Vidéo) | JoVE Journal

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

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