Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides

L’objectif global de cette expérience, dans laquelle les macrophages sont traités avec des acides gras saturés, est de démontrer que la mort cellulaire des macrophages induite par les acides gras saturés est associée aux niveaux cellulaires accumulés de céramides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation métabolique. Comme : la mort cellulaire et l’inflammation induites par les acides gras saturés.

Le principal avantage de cette technique est de fournir une approche simple mais détaillée pour propulser les conjugués d’acides gras BSA. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est difficile de préparer une solution conjuguée d’acides gras BSA stable et précise avec des résultats cohérents. Commencez cette procédure par l’ablation des os du tibia et du fémur d’une souris sauvage en bonne santé euthanasiée âgée de six à huit semaines, comme décrit dans le protocole textuel.

Ouvrez les deux extrémités du tibia et du fémur à l’aide de ciseaux et d’une cagoule de culture tissulaire stérile. Rincer les os avec une aiguille de calibre 25 avec du PBS plus deux pour cent de sérum bovin fœtal dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les cellules de la moelle osseuse à 500 g, quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, mettez à nouveau la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges pour lyser les globules rouges pendant moins d’une minute. Diluez immédiatement les cellules avec neuf millilitres de 1x PBS. Centrifugez à nouveau, comme précédemment, et décantez le surnageant.

Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de 1x PBS. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers un treillis en nylon stérile de 40 microns dans un autre tube de 15 millilitres pour éliminer les débris cellulaires et les amas de cellules. Après la centrifugation comme précédemment, remettez en suspension la pastille de cellule dans 15 millilitres de Roswell Park Memorial Institute medium 1640 avec cinq pour cent de FBS et 10 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Ensuite, placez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres et mettez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Tournez doucement le plat, sortez les cellules flottantes et comptez-les. Ensuite, plaquez 6 000 000 cellules dans une boîte de 100 millimètres avec 12 millilitres de milieu différenciateur de macrophage et 10 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation de colonie de macrophages de souris recombinant, ou MCSF, pendant deux jours.

Après une culture de deux jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2, nourrissez chaque plat avec six millilitres de milieu différenciateur de macrophage frais contenant 10 nanogrammes par millilitre de MCSF. Le cinquième jour, retirez huit millilitres de l’ancien milieu sans déranger les cellules et ajoutez 10 millimètres de milieu différenciateur de macrophage frais avec 10 nanogrammes par millilitre de MCSF. Le septième jour, récoltez les macrophages dérivés de la moelle osseuse, ou BMDM, à l’aide d’un élévateur de cellules.

Confirmer le phénotype des BMDM par cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole textuel. Pour préparer le conjugué d’acides gras BSA, préparez cinq millimolaires de sel de sodium individuel d’acides gras dans deux millimolaires BSA. Chauffez le mélange à 37 degrés Celsius ou plus si nécessaire.

Ensuite, chauffez par sonique le mélange de deux millimolaires de BSA et de sel de sodium d’acides gras jusqu’à l’obtention d’une solution claire. Après la sonication, filtrez la solution d’acide gras BSA, à travers un filtre de 0,22 micron. Ensuite, aliquote la solution filtrée dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre.

Stockez les tubes à quatre degrés Celsius pour une utilisation à court terme, ou à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Aucune précipitation ne doit être observée après le stockage à quatre degrés Celsius au réfrigérateur. Plaquez les BMDM dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits avec 0,4 million de cellules par millilitre dans un milieu de différenciation des macrophages.

Traitez les cellules avec de l’acide palmitique de 0,4 millimolaire et de l’acide stéarique pendant 16 à 24 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2. Utilisez BSA comme témoin négatif. Récoltez les cellules avec un lève-cellules après le traitement.

Ensuite, faites tourner les cellules à 500 g, quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Colorez les cellules avec Annexin V-Alexa 488 et 7-AAD dans 100 microlitres de tampon de liaison Annexin-V pendant 15 minutes à température ambiante. Diluez l’échantillon avec 200 microlitres de tampon de liaison Annexin et mélangez doucement.

Conservez les échantillons sur de la glace après la période d’incubation. Analysez les cellules colorées dès que possible par cytométrie en flux. Annexin V-Alexa 488 est détecté dans le canal FITC et 7-ADD est détecté dans le canal PerCP PerCP-Cy5.5.

Après le traitement aux acides gras, récoltez les cellules comme auparavant. Ensuite, fixez les cellules dans quatre pour cent de paraformaldéhyde pendant 30 minutes. Lavez l’échantillon avec un millimètre de 1x PBS avant de le faire tourner comme précédemment.

Après avoir décanté le surnageant, colorez les cellules avec l’anticorps primaire anti-céramide dans 100 microlitres de 1x tampon de perméabilisation pendant 30 minutes. Après avoir lavé et centrifugé les cellules comme précédemment, colorez les cellules avec l’anticorps secondaire anti-IgM de souris dans 100 microlitres de 1x tampon de perméabilisation pendant 30 minutes. Lavez et essorez à nouveau les cellules comme avant.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de 1x PBS et analysez les cellules colorées par cytométrie en flux. Les BMDM ont été cultivées in vitro avec des niveaux obèses d’acides gras alimentaires et la mort cellulaire des macrophages a été mesurée à l’aide de la coloration par cytométrie en flux. Par rapport au contrôle BSA, les acides gras saturés, en particulier les acides stériques, ont induit une mort cellulaire significative des BMDM.

Les cellules mortes se sont révélées être une population doublement positive marquée par l’Annexine V et le 7-AAD. De plus, la mort cellulaire induite par les acides gras saturés est positivement associée aux niveaux cellulaires de céramides accumulés dans les macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les conjugaisons d’acides gras BSA et de traiter les macrophages avec des conjugués d’acides gras BSA pour étudier la mort cellulaire et l’inflammation.

Lors de son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’inflammation métabolique pour explorer la mort cellulaire et l’inflammation induites par les acides gras saturés dans l’obésité.