Name: Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez comment les acides gras saturés induisent la mort cellulaire des macrophages via l'accumulation de céramides. Cette méthode utilise des conjugués BSA-acides gras pour étudier l'inflammation métabolique.

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Ce travail a été soutenu partiellement par les fonds de démarrage de l’Université de Louisville et Institut National du Cancer (Bethesda, MD) accorde R01CA177679, R01CA180986.

le protocole a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Louisville.
 1. Macrophages dérivés la moelle osseuse de souris (BMDMs) <ol><li>euthanasier une souris de type sauvage âgés de 6 à 8 semaines, en bonne santé à l’aide de CO 2. Épinglez-le vers le bas pour un panneau de mousse et vaporiser avec l’éthanol à 70 % jusqu'à ce qu’il est trempé. Enlever les os de tibia/fémur avec pinces et ciseaux. Mettez-les dans un plat de Pétri avec 5 mL 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Effectuez toutes les procédures dans des conditions stériles.</li>
	<li>Découpé les deux extrémités de l’os du tibia/fémur avec un ciseau dans une hotte de vitroplants stérile. Vider l’OS avec une aiguille 25 G avec PBS + 2 % sérum fœtal (SVF) dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les cellules de la moelle osseuse à x 500 g, 4 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans le tampon de lyse de globules rouges de 1 mL à lyser les globules rouges (RBC) pour moins de 1 min. diluer immédiatement avec du PBS 1 x 9 mL. Centrifuger à nouveau comme à l’étape 1.3. Décanter les surnageants.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans du PBS 1 x 10 mL, filtrer la suspension cellulaire au travers d’une maille de nylon stérile 40 μm dans un autre tube de 15 mL pour enlever les débris/amas de cellules. Centrifuger à nouveau comme en 1.3. Décanter les surnageants.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 15 mL de Roswell Park Memorial Institute moyen FBS (RPMI) 1640 avec 5 % et 10 gentamicine μg/mL, plaque les cellules dans un plat de culture de tissu de 100 mm à 37 o C incubateur pour 60 min. agiter doucement le plat, retirez le flottant cellules et dénombrer.</li>
	<li>Plaque 6 x 10 6 cellules dans un plat de 100 mm avec des macrophages 12 mL différencier les médias (RPMI 1640 avec 5 % FBS et gentamicine 10 μg/mL, mélangé avec 30 % L929 milieux conditionnés 10) avec des macrophages de souris recombinant 10 ng/mL facteur de stimulation des colonies (M-CSF) pour 2 jours.</li>
	<li>Après la mise en culture pendant 2 jours dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2, nourrir chaque plat avec macrophages frais 6 mL, différencier les médias 10 ng/ml de M-CSF.</li>
	<li>Le jour 5, prendre 8 mL d’anciens médias dehors sans déranger les cellules et ajouter macrophage frais 10 mL, différencier les médias 10 ng/ml de M-CSF.</li>
	<li>Jour 7, récolter les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) à l’aide d’un poussoir de cellule. 
	NOTE : Macrophages ci-joint également peuvent être dissociés 5 ml 1 mM EDTA dans du PBS 1 x pendant 5 à 10 min après avoir enlevé les cellules de flotteur et laver la plaque deux fois avec du PBS 1 x 5 mL. Centrifuger les cellules comme dans l’étape 1.3. eux resuspendre dans frais macrophage différencier les médias et les compter avec un hémocytomètre.
	<ol><li>Confirmer les BMDMs &#39; phénotype par cytométrie en flux comme décrit 5. Préparer la souris dérivée de macrophages dans une certaine concentration pour les études suivantes.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-gras acide conjugué préparation <ol><li>Prepare 2 mM BSA dans du PBS stérile. Par exemple, peser 6,65 g BSA, ajouter 30 mL 1 x PBS pour dissoudre, puis ajoutez plus de PBS jusqu'à 50 mL, mise à l’échelle des composants pour faire 2 mM BSA dans du PBS 1 x.</li>
	<li>Sel de sodium individuels de 5 mM de préparation des acides gras en 2 mM BSA. Chauffez à 37 ° C ou plus, si nécessaire et laisser agir le mélange de 2 mM BSA et sel de sodium des acides gras jusqu'à l’obtention d’une solution claire. 
	Remarque : Par rapport aux acides gras insaturés, acides gras saturés besoin d’une température plus élevée et plus de temps sonication pour dissoudre.</li>
	Filtre de <li>filtrer la solution gras-acide-BSA à travers un 0,22 µm, partie aliquote dans des microtubes stériles de 1,5 mL tubes et de les stocker à 4 ° C pour usage à court terme ou à-20 ° C pendant l’entreposage à long terme. Aucune précipitation ne doit être observée après stockage à 4 ° C dans le réfrigérateur.</li>
</ol> 3. Saturé d’acides gras induire la cellule mort de souris moelle osseuse Macrophages dérivés <ol><li>les BMDMs dans une plaque de culture de tissus de 24 puits sur plaque avec 0,4 x 10 6/ml dans le macrophage, différencier les médias.</li>
	<li>Traiter les cellules avec les 0,4 mM d’acide palmitique et l’acide stéarique à un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2 pendant 16 à 24 heures. Utiliser des BSA comme contrôle négatif.</li>
	<li>Récolter les cellules avec un releveur de cellule après traitement et tournez en bas les cellules à 500 x g, 4 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Tacher les cellules avec l’annexine V-Alexa 488 et 7-Aminoactinomycine D (7-AAD) dans 100 μL annexine tampon de liaison V pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Diluer l’échantillon avec 200 µL de tampon d’annexine-liaison, mélanger doucement, puis conserver les échantillons sur la glace après la période d’incubation.</li>
	<li>Analyser les cellules colorées dès que possible par écoulement cytometry 5. Annexine V-Alexa 488 est détectée dans le canal de la FITC et 7-AAD est détectée dans le canal de PerCP/PerCP-Cy5.5.</li>
</ol> 4. Coloration de céramide intracellulaire <ol><li>après traitement aux acides gras, récolter les cellules comme à l’étape 3.3. Puis fixer les cellules à la paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min.</li>
	<li>Laver l’échantillon avec du PBS 1 x 1 mL, tourner vers le bas comme étape 3.3 et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Colorer les cellules avec l’anticorps primaire anti-céramide (dilution 1 : 200) dans le tampon de le perméabilisation 1 x de 100 μL pendant 30 min.</li>
	<li>Lavage et essorage bas les cellules à nouveau comme à l’étape 4.2.</li>
	<li>Colorer les cellules avec l’anticorps secondaire IgM anti-souris (dilution 1/500) dans le tampon de le perméabilisation 1 x de 100 μL pendant 30 min.</li>
	<li>De lavage et d’essorage en bas les cellules à nouveau comme à l’étape 4.2. Ajouter 250 μL 1 x PBS et d’analyser les cellules colorées par écoulement cytometry 5. 
	Remarque : Voir la liste détaillée de réactif dans le tableau des équipements et de réactifs.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans conflits d’intérêts financiers.

La bonne préparation de solution d’acide gras est d’une importance critique pour étudier la fonction biologique des acides gras. La neutralisation de l’acide gras augmente sa solubilité dans une solution aqueuse. Toutefois, les sels de sodium des acides gras, en particulier les acides gras saturés, sont encore de faible solubilité dans l’eau ou PBS que nous avons observé. Une méthode consiste à utiliser l’éthanol à 95-100 % pour aider à dissoudre les acides gras1. En utilisant cette méthode, on pe...

Les acides gras jouent un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique et dans la synthèse des phospholipides membranaires dans différents types de cellules. Les acides gras ont une faible solubilité dans l’eau. Une préparation appropriée de l’acide gras est d’une importance cruciale pour étudier les fonctions biologiques des acides gras dans les cellules de mammifères. Lorsque les acides gras sont préparés avec de l’éthanol, beaucoup d’acides gras peuvent montrer leur effet toxique savon (détergent) sur la membrane cellulaire, même à des concentrations relativement faibles1. Un transporteur naturel, important pour les acides gras libres dans le sérum, sérum albumine est considéré comme un bon support pour acides gras livraison in vitro d’acides gras fonction essais2,3,4. Toutefois, les détails de la préparation des acides gras et l’albumine sérique conjuguées ne sont habituellement pas disponibles même si les nombreux Articles de recherche à l’aide d’acides gras ont été publiés.
Les macrophages expriment très protéine acide gras épidermique et adipeuse liant les acides gras protéine5,6,7,8. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés qui pourrait réguler leurs fonctions immunitaires. Afin d’étudier l’impact des acides gras sur les macrophages et autres cellules, différentes méthodes de préparation d’acides gras ont été appliquées1,7,9. En utilisant convenablement préparé l’acide gras/sérum albumine conjugués d’étudier l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages est crucial dans l’obtention des données significatives sur le plan biologique. Études sur l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages peuvent fournir des connaissances de base et des cibles thérapeutiques potentielles relatives au métabolisme des acides gras dans les macrophages impliqués maladies.

<table><tbody><tr><td>Bain à ultrasons CPX&nbsp ;</td><td>Bransonic</td><td>Modèle 2800</td><td></td></tr><tr><td>Palmitate de sodium (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Stéarate de sodium (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA), sans acides gras</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de stimulation des colonies de macrophages de souris (mM-CSF)&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire,&nbsp ; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V, conjugué Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-céramide (IgM de souris)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone : MID 15B4</td></tr><tr><td>Anticorps IgM anti-souris de chèvre, & micro-chaîne, FITC conjugué</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fixation</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de liaison Annexine V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>cellules L929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Lève-cellule&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Remarque : M.W. est pour le poids moléculaire.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Les macrophages expriment très épidermique d’acide gras-protéine et protéine acide gras adipeuse. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés, qui pourrait jouer un rôle essentiel dans la régulation de leurs fonctions immunitaires. De nombreuses études ont montré que les divers acides gras, saturés ou insaturé, mai possèdent différents impacts sur la croissance cellulaire et la fonction. Toutefois, les approches utilisées pour la préparation de l’acide gras varient, qui peut conduire à des résultats non physiologiques. Albumine sérique, un support naturel pour les acides gras dans le sang périphérique chez les mammifères, est recommandé pour former un complexe avec le sel de sodium des acides gras conjugué pour étudier la fonction acide gras dans les cellules de mammifères, ce qui minimise la toxicité du savon d’acide gras. Ainsi, un simple, relativement rapide, chauffage et sonification méthode est développé et présenté ici pour formation conjuguée de l’acide gras BSA. Les auteurs décrivent un protocole à l’aide d’acides gras saturés, notamment les acides stéarique pour induire la mort cellulaire sévère dans les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris. Par ailleurs, nous démontrent que la mort cellulaire d’induite par l’acide gras saturé est corrélée positivement avec des niveaux de céramide cellulaires accumulés. Cette méthode peut être appliquée pour les études de l’impact des acides gras sur les autres cellules de mammifères.

L’obésité augmente les concentrations en acides gras libres dans le sérum. Comme les phagocytes professionnels, macrophages prennent activement des acides gras pour maintenir l’homéostasie de l’hôte. Au cours de ces processus, surchargée de lipides peuvent provoquer la mort des cellules macrophages. À cette fin, nous avons cultivé BMDMs in vitro avec des niveaux d’acides gras alimentaires et la mort des cellules macrophages mesurée à l’aide de coloration de cytométrie en flux obè...

Nous illustrons une méthode directe pour calculer des macrophages de souris primaires des cellules de la moelle osseuse et une méthode simple pour préparer l’acide gras BSA conjugués. Ensuite, nous démontrons que les acides gras saturés peut induire la mort des cellules macrophages, et la mort de ces cellules est corrélée positivement avec accumulation cellulaire de niveaux de céramide.

Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

L’objectif global de cette expérience, dans laquelle les macrophages sont traités avec des acides gras saturés, est de démontrer que la mort cellulaire des macrophages induite par les acides gras saturés est associée aux niveaux cellulaires accumulés de céramides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation métabolique. Comme : la mort cellulaire et l’inflammation induites par les acides gras saturés.Le principal avantage de cette technique est de fournir une approche simple mais détaillée pour propulser les conjugués d’acides gras BSA. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est difficile de préparer une solution conjuguée d’acides gras BSA stable et précise avec des résultats cohérents. Commencez cette procédure par l’ablation des os du tibia et du fémur d’une souris sauvage en bonne santé euthanasiée âgée de six à huit semaines, comme décrit dans le protocole textuel.Ouvrez les deux extrémités du tibia et du fémur à l’aide de ciseaux et d’une cagoule de culture tissulaire stérile. Rincer les os avec une aiguille de calibre 25 avec du PBS plus deux pour cent de sérum bovin fœtal dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les cellules de la moelle osseuse à 500 g, quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, mettez à nouveau la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges pour lyser les globules rouges pendant moins d’une minute. Diluez immédiatement les cellules avec neuf millilitres de 1x PBS. Centrifugez à nouveau, comme précédemment, et décantez le surnageant.Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de 1x PBS. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers un treillis en nylon stérile de 40 microns dans un autre tube de 15 millilitres pour éliminer les débris cellulaires et les amas de cellules. Après la centrifugation comme précédemment, remettez en suspension la pastille de cellule dans 15 millilitres de Roswell Park Memorial Institute medium 1640 avec cinq pour cent de FBS et 10 microgrammes par millilitre de gentamicine.Ensuite, placez les cellules dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres et mettez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Tournez doucement le plat, sortez les cellules flottantes et comptez-les. Ensuite, plaquez 6 000 000 cellules dans une boîte de 100 millimètres avec 12 millilitres de milieu différenciateur de macrophage et 10 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation de colonie de macrophages de souris recombinant, ou MCSF, pendant deux jours.Après une culture de deux jours dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2, nourrissez chaque plat avec six millilitres de milieu différenciateur de macrophage frais contenant 10 nanogrammes par millilitre de MCSF. Le cinquième jour, retirez huit millilitres de l’ancien milieu sans déranger les cellules et ajoutez 10 millimètres de milieu différenciateur de macrophage frais avec 10 nanogrammes par millilitre de MCSF. Le septième jour, récoltez les macrophages dérivés de la moelle osseuse, ou BMDM, à l’aide d’un élévateur de cellules.Confirmer le phénotype des BMDM par cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole textuel. Pour préparer le conjugué d’acides gras BSA, préparez cinq millimolaires de sel de sodium individuel d’acides gras dans deux millimolaires BSA. Chauffez le mélange à 37 degrés Celsius ou plus si nécessaire.Ensuite, chauffez par sonique le mélange de deux millimolaires de BSA et de sel de sodium d’acides gras jusqu’à l’obtention d’une solution claire. Après la sonication, filtrez la solution d’acide gras BSA, à travers un filtre de 0,22 micron. Ensuite, aliquote la solution filtrée dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre.Stockez les tubes à quatre degrés Celsius pour une utilisation à court terme, ou à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Aucune précipitation ne doit être observée après le stockage à quatre degrés Celsius au réfrigérateur. Plaquez les BMDM dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits avec 0,4 million de cellules par millilitre dans un milieu de différenciation des macrophages.Traitez les cellules avec de l’acide palmitique de 0,4 millimolaire et de l’acide stéarique pendant 16 à 24 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de CO2. Utilisez BSA comme témoin négatif. Récoltez les cellules avec un lève-cellules après le traitement.Ensuite, faites tourner les cellules à 500 g, quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Colorez les cellules avec Annexin V-Alexa 488 et 7-AAD dans 100 microlitres de tampon de liaison Annexin-V pendant 15 minutes à température ambiante. Diluez l’échantillon avec 200 microlitres de tampon de liaison Annexin et mélangez doucement.Conservez les échantillons sur de la glace après la période d’incubation. Analysez les cellules colorées dès que possible par cytométrie en flux. Annexin V-Alexa 488 est détecté dans le canal FITC et 7-ADD est détecté dans le canal PerCP PerCP-Cy5.5.Après le traitement aux acides gras, récoltez les cellules comme auparavant. Ensuite, fixez les cellules dans quatre pour cent de paraformaldéhyde pendant 30 minutes. Lavez l’échantillon avec un millimètre de 1x PBS avant de le faire tourner comme précédemment.Après avoir décanté le surnageant, colorez les cellules avec l’anticorps primaire anti-céramide dans 100 microlitres de 1x tampon de perméabilisation pendant 30 minutes. Après avoir lavé et centrifugé les cellules comme précédemment, colorez les cellules avec l’anticorps secondaire anti-IgM de souris dans 100 microlitres de 1x tampon de perméabilisation pendant 30 minutes. Lavez et essorez à nouveau les cellules comme avant.Ensuite, ajoutez 250 microlitres de 1x PBS et analysez les cellules colorées par cytométrie en flux. Les BMDM ont été cultivées in vitro avec des niveaux obèses d’acides gras alimentaires et la mort cellulaire des macrophages a été mesurée à l’aide de la coloration par cytométrie en flux. Par rapport au contrôle BSA, les acides gras saturés, en particulier les acides stériques, ont induit une mort cellulaire significative des BMDM.Les cellules mortes se sont révélées être une population doublement positive marquée par l’Annexine V et le 7-AAD. De plus, la mort cellulaire induite par les acides gras saturés est positivement associée aux niveaux cellulaires de céramides accumulés dans les macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les conjugaisons d’acides gras BSA et de traiter les macrophages avec des conjugués d’acides gras BSA pour étudier la mort cellulaire et l’inflammation.Lors de son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’inflammation métabolique pour explorer la mort cellulaire et l’inflammation induites par les acides gras saturés dans l’obésité.

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Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Ce protocole permet un chercheur d’isoler et de caractériser les tissus-résident hallmark de macrophages dans divers tissus enflammés extraites de modèles induite par le régime alimentaire des troubles métaboliques.

Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Ce protocole décrit le flux de travail pour obtenir des macrophages dérivés des monocytes (MDM) à partir d’échantillons de sang humain, une méthode simple pour introduire efficacement des rapporteurs de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) de caspase inflammatoire dans le MDM humain sans compromettre la viabilité et le comportement des cellules, et une approche basée sur l’imagerie pour mesurer l’activation des caspases inflammatoires dans les cellules vivantes.

Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Découvrez comment les acides gras saturés induisent la mort cellulaire des macrophages via l'accumulation de céramides. Cette méthode utilise des conjugués BSA-acides gras pour étudier l'inflammation métabolique.

Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides

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