Ultrastructure Mitochondrial 3D de Drosophila vol Indirect musculaire révélée par la série-section Electron Tomography

L’objectif général de cette vidéo est de déterminer l’application de la tomographie électronique en série pour étudier l’ultrastructure mitochondriale du muscle de vol indirect de la drosophile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire de la structure, telles que la structure et la relation fonctionnelle avec les mitochondries. Le principal avantage de cette technique est que l’ultrastructure cellulaire est révélée en trois dimensions.

Pour commencer l’expérience, anesthésez cinq spécimens de Drosophola sur de la glace et immergez chaque mouche dans un millilitre d’agarose à faible point de fusion à 4 % dans un tampon de phosphate. Laissez l’agarose se solidifier sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’un microtome à lame vibrante, coupez Drosophola enrobé de gel d’agarose en tranches de 100 micromètres d’épaisseur.

Immerger les tranches dans une solution fixatrice contenant 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de phosphate molaire à point zéro. Lavez les sections de tissu dans trois gouttes de tampon de phosphate, puis poursuivez avec un lavage avec deux gouttes de tampon de phosphate avec 20 % de BSA. Placez les sections dans des supports en or pour la congélation à haute pression, ou HPF, remplis de tampon et de 20 % BSA.

Ensuite, chargez l’échantillon contenant les supports dans un congélateur à haute pression conformément au manuel d’utilisation. Après la congélation, libérez les supports du support sous l’azote liquide et transférez-les dans un dispositif de substitution libre refroidi à moins 140 degrés Celsius. Effectuez le protocole de substitution libre avec le cocktail FS contenant 2 % de glutaraldéhyde, 2 % de tétroxyde d’osmium, 0,1 % d’acétate d’uranyle dans de l’acétone.

Incorporer les échantillons dans de la résine à température ambiante. Ensuite, polymérisez la résine à 65 degrés Celsius pendant 16 heures. Coupez les blocs de l’échantillon pour exposer la face du bloc souhaité qui contient du tissu.

Ensuite, prétraitez des particules d’or de 10 nanomètres avec 1 % de BSA pendant 30 minutes. Lavez et suspendez les particules d’or dans une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS. Superposez les particules d’or sur des grilles coulissantes en cuivre recouvertes d’un film de carbone pour créer des marqueurs repères.

Découpez des coupes en série de 200 à 250 nanomètres d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome. Ensuite, collectez les sections en série sur des grilles de fentes à l’aide d’une boucle parfaite pour les sections minces. Colorez les sections avec du citrate de plomb Reynolds pendant 10 minutes.

Superposez une deuxième couche de particules d’or repères sur le dessus des sections. Chargez la grille sur un support de tomographie à deux axes et insérez-la dans le microscope électronique à transmission fonctionnant à 200 kilovolts. Alignez le microscope sur le foyer eucentrique.

Configurez le logiciel de collecte automatique de données, ajustez et alignez le faisceau d’électrons au réglage d’imagerie multi-échelle, acquérez des références sombres et lumineuses de la caméra dans une zone vide sans film de carbone sous le réglage de collecte par tomographie. Ensuite, collectez un atlas de grille à faible grossissement. Sélectionnez des mitochondries sur des coupes en série comme cibles pour la collecte par tomographie, acquérez une série d’inclinaisons de moins 60 degrés à plus 60 degrés avec des incréments de deux degrés sur l’axe A pour chaque cible.

Enfin, collectez la deuxième série d’inclinaisons. Faites pivoter le porte-échantillon de 90 degrés. Acquérir un nouvel atlas.

Sélectionnez les positions correspondantes et acquérez la série d’inclinaison sur l’axe B pour chaque cible. En utilisant cette méthode, des micrographies 2D et des tomographes 3D à partir de coupes en série couvrant tout le volume d’une mitochondrie ont été générés. Les tomogrammes de section en série joints sont projetés pour créer une section longitudinale avec l’axe z représenté verticalement.

La tomographie électronique en série a été appliquée pour analyser les caractéristiques structurelles des crêtes mitochondriales qui reflètent leur état énergétique et leur vieillissement. Des coupes de reconstructions tomographiques d’électrons mitochondriaux révèlent des commutateurs entre les membranes lamellaires à travers l’axe z. Segmentation tomographique illustrant une spirale gaucher en 3D.

Les modèles de commutation des crêtes ont été analysés et les couleurs rendues sur le modèle de segmentation. Une coupe tomographique montre la confluence latérale de la matrice à travers les membranes des crêtes. Un modèle de segmentation du tomogramme a été généré en montrant la confluence de la matrice latérale et les crêtes représentatives.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la tomographie électronique en série, qui peut être adaptée pour étudier n’importe quelle structure cellulaire en trois dimensions.