Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

L’objectif global de cette procédure est de détecter quantitativement les interactions protéine-protéine dans un système d’expression transitoire. Cette mesure peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de transaction quan-signal, telles que la surveillance quantitative des directions de nos protéines protéiques après un traitement chimique ou environnemental. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un luminomètre ou une caméra CCD pour détecter l’activité luciféreuse, qui représente l’intensité de la direction de la protéine afin que les résultats soient plus précis.

Pour commencer cette procédure, ajoutez un millilitre d’une solution contenant cinq pour cent d’hypochlorite de sodium et zéro virgule un pour cent de triton x cent à un tube de microcentrifugation à un point cinq millilitres contenant des graines. Laissez reposer la solution pendant cinq minutes pour stériliser les graines. Ensuite, lavez les graines à l’eau stérile cinq fois.

Suspendez les graines lavées dans deux cents microlitres d’eau stérile. À l’aide de pointes fines, placez soigneusement les graines individuelles sur la surface d’un milieu gélosé MS plaqué. Conservez les plaques à quatre degrés Celsius pendant trois jours pour synchroniser la germination.

Après cela, conservez des plaques moyennes dans des conditions de croissance normales pendant dix jours. Transférez les plants en germination dans le sol en veillant à ne pas endommager les racines. Couvrez le plateau avec un couvercle en plastique transparent pendant la nuit pour maintenir l’humidité.

Cultivez les plantes dans une salle de croissance contrôlée pendant sept semaines, lorsqu’elles seront prêtes pour l’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens. Pour commencer, délivrez cent cinquante nanogrammes de plasmides dans la souche cellulaire compétente a-tumefaciens GV3101. Placez les tubes contenant la culture d’a-tumefaciens dans un agitateur et incubez pendant quatre heures.

À l’aide d’une tige de verre, transférez la culture des tubes dans les milieux LB. Culture a-tumefaciens et milieu gélosé LB à 28 degrés Celsius pendant quatre jours. Ensuite, préparez-vous à inoculer une seule colonie d’a-tumefaciens de chaque plaque dans son propre tube contenant trois millilitres de milieu liquide LB.

Agiter à 280 RBM à 28 degrés Celsius pendant 24 heures pour propager la culture. Ensuite, transférez 75 microlitres de la culture bactérienne dans 15 millilitres de milieu liquide LB frais contenant 15 microgrammes par millilitre de kanamycine et 50 microgrammes par millilitre de rifampicine. Cultivez les bactéries à 220 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 8 heures jusqu’à ce que la DO 600 soit comprise entre 0,5 et 1.

Après cela, transférez la culture dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres. Centrifugeuse à 4000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez le surnageant et remettez la palette en suspension dans 15 millilitres de solution de transformation.

Centrifugeuse à 4000 fois la gravité et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, répétez l’étape de suspension et de centrifugation une fois de plus. Jetez le surnageant et remettez la palette en suspension dans 5 millilitres de solution de transformation.

Laissez reposer la palette remise en suspension pendant deux heures à température ambiante dans des conditions sombres. Ensuite, soit ajoutez une solution de transformation dans l’OD600 est de 0,5, soit combinez deux échantillons de volume égal pour tester les interactions protéiques appariées. À l’aide d’une aiguille de seringue d’un millilitre, infiltrez les cellules en suspension dans les quatrième à septième feuilles.

Après cela, couvrez immédiatement les plantes avec un couvercle en plastique noir pendant 12 heures. Tout d’abord, les plantes doivent être en très bonne santé pour assurer le succès. Deuxièmement, assurez-vous de ne pas endommager les feuilles pendant le processus d’infiltration.

Gardez le plateau dans l’obscurité pendant 12 heures. Ensuite, cultivez les plantes dans des conditions normales pendant 2 à 4 jours avant de détecter l’activité de la luciférase. Pour commencer la méthode d’imagerie, détachez une feuille infiltrée.

Placez l’ensemble de la notice sur une assiette de milieu gélosé MS. À l’aide d’un flacon pulvérisateur de 50 millilitres, vaporisez le tampon de travail luciferon sur le côté adaxial des feuilles. Ensuite, gardez dans l’obscurité pendant 5 minutes pour éteindre l’autofluorescence de la chlorophylle.

Utilisez un appareil d’imagerie CCD refroidi à faible lumière refroidi à moins 30 degrés Celsius pour capturer des images avec un temps d’exposition rempli de lumière de 50 millisecondes et un temps de détection de luminescence de 1 minute. Après cela, découpez des fragments de feuilles dans la zone d’infiltration des feuilles de N-benthamiana. Immergez les fragments dans 100 microlitres d’eau déminéralisée dans les puits de plaque blanche de 96 puits.

Ajoutez dix microlitres de tampon de travail luciferon. Laisser reposer l’assiette 5 minutes. Ensuite, effectuez tout traitement spécifique souhaité pour étudier la dynamique d’interaction des protéines, et mesurez la luminescence directement avec un luminomètre commercial.

Voici la démonstration de l’activité luciférienne pour représenter les interactions COP 1 SPA 1. L’activité luciféreuse, qui est détectée par luminescence, est imagée par une caméra CCD. Les interactions COP 1 SPA 1 entraînent une mutation du cuivre de la luciférase fonctionnelle.

L’activité de la luciférase sous traitement au jasmin 8 au fil du temps est ensuite déterminée. Les interactions COP 1 SPA 1 représentées par l’activité de la luciférase diminuent progressivement dans l’obscurité. Le traitement au Jasmine 8 réduit encore ces interactions.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 1 semaine, une fois les plantes prêtes si elle est bien exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des plantes saines. Infiltrer les feuilles avec précaution et inclure les contrôles appropriés.

Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des transactions de signaux pour explorer rapidement la dynamique d’interaction protéine-protéine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire pousser des plants de tabac, d’infiltrer des agrobactéries dans les feuilles de tabac et de détecter les activités luciféreuses.