Name: Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'analyse de complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour quantifier les interactions protéine-protéine en biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences naturelles de la Province du Jiangsu (BK20140919), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31470375), la priorité académique programme développement de Jiangsu établissements d’enseignement supérieur et le projet de Lan Qing.

1. préparation des plantes (8 semaines)
<ol><li>Mettre 50 graines de Nicotiana benthamiana dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 1 mL de 5 % NaClO et solution à 0,1 % X-100 Triton (V/V) et laisser pendant 5 min stériliser les graines.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau stérile 5 fois et suspendre les graines dans 200 µL d’eau stérile.</li>
	<li>Soigneusement lieu de graines individuelles sur la surface de la gélose MS (1 L: 1 x sels de Murashige et Skoog, 10 g de saccharose, pH 5,8 (KOH), 1 % d’agar) avec pointes fines et plaques moyen magasin à 4 ° C pendant 3 jours pour synchroniser la germination. Remarque : Pour éviter la contamination microbienne, effectuez cette étape sur un banc propre. Il n’est pas nécessaire d’agiter le tube pendant la stérilisation.</li>
	<li>Placer les plaques moyens dans des conditions de croissance normales (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 blanc intensité lumineuse) pendant 10 jours et puis transférez les plantules dans le sol. Remarque : Veillez à insérer des racines des plantules dans le sol et ne pas endommager les racines. Recouvrir le plateau d’un couvercle en plastique transparent du jour au lendemain pour conserver l’humidité.</li>
	<li>Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance maîtrisée sur une 16 h/8 h lumière/obscurité cycle et 70 % d’humidité. 7 semaines N. benthamiana plants sont prêts pour l’infiltration d’Agrobacteriumtumefaciens (Figure 1A). NOTE : Arroser les plantes et lutter contre les ravageurs au besoin pour maintenir des plantes en bonne santé.</li>
</ol>2. Expression transitoire dans les feuilles de N. Benthamiana (7-10 jours)
<ol><li>Livrer 150 ng de plasmides (plasmide contrôle pEGAD-HA-LUC, vecteur vide et plasmide construite pour LCI assay, dans ce cas, nous avons utilisé pCAMBIA1300-Nluc et pCAMBIA1300-Cluc pour construction de plasmide) dans la cellule compétente a. tumefaciens souche GV3101 avec un méthode standard d’électroporation.</li>
	<li>La culture a. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar moyen (1 L: 10 g NaCl, extrait de levure 5 g, 10 g tryptone, 1,5 % d’agar) contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de rifampicine à 28 ° C pendant 4 jours. Remarque : Le choix des antibiotiques dépend du vecteur et la souche d’a. tumefaciens utilisée.</li>
	<li>Ensemencer une simple colonie a. tumefaciens de chaque plaque dans 3 mL de milieu liquide LB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de la rifampicine et l’agiter à 220 tr/mn à 28 ° C pendant 24 h propager la culture cellulaire.</li>
	<li>Transférer 75 µL de culture bactérienne dans 15 mL frais LB milieu liquide contenant 50 µg/mL de kanamycine et 50 µg/mL de rifampicine, il dilue par un facteur 200. Culture de la bactérie à 220 tr/mn à 30 ° C pendant environ 8 h, jusqu'à ce que OD600 entre 0,5 et 1,0.</li>
	<li>Transfert de la culture liquide a. tumefaciens dans des tubes à centrifuger 15 mL et centrifuger à 4 000 x g et 4 ° C pendant 15 min. jeter le surnageant et suspendre le culot dans 15 mL de solution de transformation pour laver le culot.</li>
	<li>Tourner le tube à 4 000 x g et 4 ° C pendant 15 min et éliminer le surnageant. Répétez l’étape de lavage une fois de plus.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 5 mL de solution de transformation et conserver pendant 2 h à température ambiante. Ajuster la densité des cellules pellet a. tumefaciens avec solution de transformation jusqu'à ce que la concentration finale de OD600 est de 0,5, ou deux échantillons de mélange à volume égal pour des interactions de protéine appariés test.</li>
	<li>S’infiltrer cellules suspendues sur la 4ème au 7ème feuilles avec une seringue sans aiguille de 1 mL (Figure 1B-C). Après infiltration, couvrez les plantes immédiatement avec un couvercle en plastique noir et placez le plateau dans l’obscurité pendant 12 h. Après cela, faire pousser des plantes comme d’habitude pour 2 à 4 jours avant la détection des activités LUC. Remarque : Choisir des feuilles saines de taille similaire. L’infiltration des quatre zones différentes dans une seule feuille est très bien.</li>
</ol>3. détection d’activité de la luciférase (un jour)
Remarque : Il y a deux façons de contrôler l’activité de la luciférase. L’un est basé sur l’imagerie, et l’autre est de mesurer quantitativement l’activité de la luciférase.
<ol><li>
Méthode d’imagerie
	<ol>
<li>Détachez une feuille infiltrée et mettre le feuillet sur MS-agar.</li>
		<li>Pulvérisation luciférine travail tampon sur la surface adaxiale des feuilles avec un vaporisateur de 50 mL. Conserver les matériaux dans l’obscurité pendant 5 min étancher l’auto-fluorescence de la chlorophylle.</li>
		<li>Utilisez un CCD refroidi par faible luminosité appareil (refroidi à-30 ° C) d’imagerie afin de capturer des images (Figure 2). Le temps d’exposition de lumière-déposer est de 50 ms, et temps de détection de luminescence est de 1 min. Remarque : Réglez les paramètres selon le manuel de la machine. Des températures plus basses permettra d’améliorer le rapport signal-bruit pour améliorer la qualité de l’image.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vous pouvez également mesurer luminescence directement avec un luminomètre commercial.<ol>
<li>Soigneusement découpé de fragments de feuilles (environ 0,25 cm2) de la zone d’infiltration des feuilles N. benthamiana et plonger le disque de feuilles dans 100 µL d’eau déionisée dans une plaque à 96 puits blanche (Figure 3).</li>
		<li>Ajouter 10 µL de tampon de travail luciférine et laisser pendant 5 min. Effectuez des traitements spécifiques afin d’étudier la dynamique d’interaction de protéine. Remarque : Détecter la luminescence avec un luminomètre à des moments différents pour obtenir la dynamique de l’activité luciférase, qui représente la cinétique des interactions protéine-protéine sous certains traitements. Cette méthode a des avantages pour tester un grand nombre de paires de protéines en même temps. Pour ceux sans un luminomètre commercial, examiner l’abondance de protéine luciférase par western blot, donc se référer à la LUC activité quantitativement. Si la lumière n’est pas forcément nécessaire, juste garder la plaque dans le luminomètre et mesurer la luminescence à différents moments. Dans le cas contraire, déplacez le plateau dans une chambre de croissance pendant l’intervalle de détection. Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, utilisez au moins trois réplicats biologiques. Bien que les activités LUC de zones différentes de l’infiltration peut varier, leur évolution est conformes après normalisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est simple et reproductible pour l’étude in vivo des interactions protéine-protéine et particulièrement adapté pour la détection dynamique d’interaction de protéine sous traitement exogène. L’étape clé de ce dosage est N. benthamiana infiltration. Pour assurer le succès de l’infiltration, les plantes doivent être très sains. Un autre facteur critique est alors de vérifier l’activité de la luciférase après infiltration. Il n’y a aucune bonne réponse pour cette question. Les cherch...

Afin de coordonner la croissance avec son environnement, les plantes ont évolué des voies de signalisation élégants pour détecter, transmettre et répondre aux signaux de signalisation. Comme les coureurs dans une course de relais, les protéines sont les joueurs nécessaires dans la transduction du signal plante. Il a été largement reconnu que l’interaction protéine-protéine (PPI) joue un rôle majeur pour la communication cellulaire. Dégradation, l’acétylation et la phosphorylation des protéines sont tout dépendantes de l’interaction physique entre une protéine cible et ses enzymes de modification. Par exemple, les protéines de la famille Jasmonate ZIM-domaine protéique (JAZ) interagissent avec le facteur de transcription MYC2 et suppriment son activité transcriptionnelle1,2. Compte tenu de l’importance du PPI, protéine à grande échelle, interactomes chez les plantes ont été exploré récemment3,4,5. Ces résultats interactome révèlent le réseau réglementaire complexe qui coordonne les diverses fonctions cellulaires.
Il y a certaines approches établies pour le suivi des PPI. La levure deux hybride (Y2H) est la méthode la plus utilisée pour la détection de l’IPP. Y2H est facile à réaliser et adapté pour un test rapide examiner les interactions entre protéines. Y2H est également largement utilisé pour le dépistage des partenaires d’interaction inconnue pour la protéine d’intérêt spécifique. Cependant, parce que Y2H est entièrement réalisé dans la levure, il ne peut pas refléter le scénario réel en usine cellules et apporte la hautes taux de faux positifs. Une autre stratégie semblable est le test de menu déroulant. En général, deux protéines sont exprimées et purifiées à partir de cellules d’Escherichia coli mélangés et immobilisées pour détecter des interactions entre protéines. Bien que cette méthode n’est pas fastidieux, il ne peut obtenir en vivo résultats interaction non plus. Fins en vivo interaction, co-immunoprécipitation (co-IP) est l’analyse plus populaire, ce qui nécessite des anticorps de haute qualité pour l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt et ne peut pas exclure la possibilité des IPP indirecte. En outre, en raison des complexes procédures expérimentales dans co-propriété intellectuelle, les résultats varient généralement avec expertise individuelle.
Essais de reconstitution de journaliste basé avancent considérablement la détection in vivo PPI. Ces méthodes incluent la fluorescence resonance energy transfert (FRET)6, fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC)7et la complémentation de luciférase firefly imaging (LCI) test8. Bien que ces trois approches sont mieux que co-IP afin de refléter le direct en vivo PPI, frette et BiFC besoin spécifiques microscopes pour détecter les signaux de fluorescence et ne peut pas facilement quantifier l’intensité de l’interaction. En revanche, LCI profite de la luciférase firefly, qui s’allume après réaction avec son luciférine de substrat. Plus important encore, intensité de l’IPP peut être déterminée de la valeur de l’activité de la luciférase. Ainsi, LCI indique non seulement si les deux protéines interagissent ou pas, mais fournit également des informations sur la dynamique de l’interaction par traitement. Bien qu’il existe certaines méthodes établies pour surveiller l’interaction dynamique (fondée sur le surface plasmon resonance ou thermo-stabilité)9,10, ces approches nécessitent des instruments délicats ou marquage spécifique. En revanche, LCI est plus facile à réaliser et à détecter.
Le principe pour LCI, c’est que les moitiés amino-terminale et c-terminal de la luciférase (appelé N-Luc ou C-Luc, respectivement) ont été fusionnés avec la protéine A et B ces fusion deux protéines ont été simultanément exprimés dans les cellules végétales. Si A protéine interagit avec la protéine B, alors les deux moitiés de la luciférase vont être reconstituées pour être une enzyme luciférase active. Activité de la luciférase peut être détectée avec une caméra CCD ou un luminomètre. Il n’est pas nécessaire d’obtenir des transformants stables pour LCI ; expression transitoire est suffisant pour obtenir un résultat de l’interaction de haute qualité.
ANNEAU de type E3 ubiquitine ligase photomorphogenic constitutive 1 (COP1) interagit avec une myriade de facteurs de transcription et favorise leur dégradation par le protéasome 26 s11. Certains de ces facteurs de transcription COP1 ciblées sont les régulateurs positifs pour photomorphogenèse. Dans l’obscurité, COP1 interagit avec suppresseur du phytochrome A-105 1 (SPA1), qui améliore la COP1 E3 l’activité8. Après la perception de la lumière, photorécepteurs vont abroger l’interaction COP1-SPA1 pour inhiber l’activité COP1 et ensuite stabiliser COP1 substrats12,13,14. Cet exemple illustre l’importance biologique de l’étudiant PPI et déterminer la dynamique PPI.

<table><tbody><tr><td>< solution > transformation forte </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Acide morpholinéthanesulfonique</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>27,8 mM de glucose</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times ; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu ; M Acétosyringone</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5,7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Tampon de travail de la luciférine</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Sel de potassium de luciférine</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0,025 % Triton X-100</td><td></td><td>VETEC V900502&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>H2O à 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique interaction protéine-protéine

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Interactions protéines-protéines sont des mécanismes fondamentaux pour relayer la transduction du signal dans les processus cellulaires plus ; par conséquent, identification des paires d’interaction protéine-protéine nouvelle et surveillance dynamique d’interaction de protéine sont particulièrement intéressantes pour révéler comment les plantes répondent à des facteurs environnementaux et/ou des signaux du développement. Une multitude d’approches ont été développées afin d’examiner les interactions protéine-protéine, in vitro ou in vivo. Parmi eux, la complémentation de luciférase récemment créée d’imagerie (LCI) est la méthode la plus simple et plus rapide pour avoir démontré in vivo des interactions protéine-protéine. Dans cet essai, la protéine A ou la protéine B est fondue avec la partie amino-terminale ou carboxyl-terminale de la luciférase, respectivement. Lorsque la protéine A interagit avec la protéine B, les deux moitiés de la luciférase vont être reconstitués pour former un enzyme luciférase fonctionnel et actif. Activité de la luciférase peut être enregistrée avec un luminomètre ou une caméra CCD. Par rapport aux autres approches, le dosage LCI montre des interactions protéine-protéine qualitativement et quantitativement. L’infiltration dans les feuilles de Nicotiana benthamiana Agrobacterium est un système largement utilisé pour l’expression de la protéine transitoire. Avec la combinaison de LCI et expression transitoire, ces approches montrent que l’interaction physique entre COP1 et SPA1 a été progressivement réduite après traitement de jasmonate.

Trois étapes principales peuvent être singularisés dans ce protocole de complémentation de luciferase pour l’étude des protéines interactions in vivo, y compris la croissance des plantes, l’infiltration du tabac et le dosage de la luciférase. L’étape la plus cruciale dans le présent protocole est infiltrer liquide a. tumefaciens dans des feuilles de N. benthamiana (Figure 1).
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Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter quantitativement les interactions protéine-protéine dans un système d’expression transitoire. Cette mesure peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de transaction quan-signal, telles que la surveillance quantitative des directions de nos protéines protéiques après un traitement chimique ou environnemental. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un luminomètre ou une caméra CCD pour détecter l’activité luciféreuse, qui représente l’intensité de la direction de la protéine afin que les résultats soient plus précis.Pour commencer cette procédure, ajoutez un millilitre d’une solution contenant cinq pour cent d’hypochlorite de sodium et zéro virgule un pour cent de triton x cent à un tube de microcentrifugation à un point cinq millilitres contenant des graines. Laissez reposer la solution pendant cinq minutes pour stériliser les graines. Ensuite, lavez les graines à l’eau stérile cinq fois.Suspendez les graines lavées dans deux cents microlitres d’eau stérile. À l’aide de pointes fines, placez soigneusement les graines individuelles sur la surface d’un milieu gélosé MS plaqué. Conservez les plaques à quatre degrés Celsius pendant trois jours pour synchroniser la germination.Après cela, conservez des plaques moyennes dans des conditions de croissance normales pendant dix jours. Transférez les plants en germination dans le sol en veillant à ne pas endommager les racines. Couvrez le plateau avec un couvercle en plastique transparent pendant la nuit pour maintenir l’humidité.Cultivez les plantes dans une salle de croissance contrôlée pendant sept semaines, lorsqu’elles seront prêtes pour l’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens. Pour commencer, délivrez cent cinquante nanogrammes de plasmides dans la souche cellulaire compétente a-tumefaciens GV3101. Placez les tubes contenant la culture d’a-tumefaciens dans un agitateur et incubez pendant quatre heures.À l’aide d’une tige de verre, transférez la culture des tubes dans les milieux LB. Culture a-tumefaciens et milieu gélosé LB à 28 degrés Celsius pendant quatre jours. Ensuite, préparez-vous à inoculer une seule colonie d’a-tumefaciens de chaque plaque dans son propre tube contenant trois millilitres de milieu liquide LB.Agiter à 280 RBM à 28 degrés Celsius pendant 24 heures pour propager la culture. Ensuite, transférez 75 microlitres de la culture bactérienne dans 15 millilitres de milieu liquide LB frais contenant 15 microgrammes par millilitre de kanamycine et 50 microgrammes par millilitre de rifampicine. Cultivez les bactéries à 220 tr/min à 30 degrés Celsius pendant environ 8 heures jusqu’à ce que la DO 600 soit comprise entre 0,5 et 1.Après cela, transférez la culture dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres. Centrifugeuse à 4000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez le surnageant et remettez la palette en suspension dans 15 millilitres de solution de transformation.Centrifugeuse à 4000 fois la gravité et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, répétez l’étape de suspension et de centrifugation une fois de plus. Jetez le surnageant et remettez la palette en suspension dans 5 millilitres de solution de transformation.Laissez reposer la palette remise en suspension pendant deux heures à température ambiante dans des conditions sombres. Ensuite, soit ajoutez une solution de transformation dans l’OD600 est de 0,5, soit combinez deux échantillons de volume égal pour tester les interactions protéiques appariées. À l’aide d’une aiguille de seringue d’un millilitre, infiltrez les cellules en suspension dans les quatrième à septième feuilles.Après cela, couvrez immédiatement les plantes avec un couvercle en plastique noir pendant 12 heures. Tout d’abord, les plantes doivent être en très bonne santé pour assurer le succès. Deuxièmement, assurez-vous de ne pas endommager les feuilles pendant le processus d’infiltration.Gardez le plateau dans l’obscurité pendant 12 heures. Ensuite, cultivez les plantes dans des conditions normales pendant 2 à 4 jours avant de détecter l’activité de la luciférase. Pour commencer la méthode d’imagerie, détachez une feuille infiltrée.Placez l’ensemble de la notice sur une assiette de milieu gélosé MS. À l’aide d’un flacon pulvérisateur de 50 millilitres, vaporisez le tampon de travail luciferon sur le côté adaxial des feuilles. Ensuite, gardez dans l’obscurité pendant 5 minutes pour éteindre l’autofluorescence de la chlorophylle.Utilisez un appareil d’imagerie CCD refroidi à faible lumière refroidi à moins 30 degrés Celsius pour capturer des images avec un temps d’exposition rempli de lumière de 50 millisecondes et un temps de détection de luminescence de 1 minute. Après cela, découpez des fragments de feuilles dans la zone d’infiltration des feuilles de N-benthamiana. Immergez les fragments dans 100 microlitres d’eau déminéralisée dans les puits de plaque blanche de 96 puits.Ajoutez dix microlitres de tampon de travail luciferon. Laisser reposer l’assiette 5 minutes. Ensuite, effectuez tout traitement spécifique souhaité pour étudier la dynamique d’interaction des protéines, et mesurez la luminescence directement avec un luminomètre commercial.Voici la démonstration de l’activité luciférienne pour représenter les interactions COP 1 SPA 1. L’activité luciféreuse, qui est détectée par luminescence, est imagée par une caméra CCD. Les interactions COP 1 SPA 1 entraînent une mutation du cuivre de la luciférase fonctionnelle.L’activité de la luciférase sous traitement au jasmin 8 au fil du temps est ensuite déterminée. Les interactions COP 1 SPA 1 représentées par l’activité de la luciférase diminuent progressivement dans l’obscurité. Le traitement au Jasmine 8 réduit encore ces interactions.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 1 semaine, une fois les plantes prêtes si elle est bien exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des plantes saines. Infiltrer les feuilles avec précaution et inclure les contrôles appropriés.Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des transactions de signaux pour explorer rapidement la dynamique d’interaction protéine-protéine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire pousser des plants de tabac, d’infiltrer des agrobactéries dans les feuilles de tabac et de détecter les activités luciféreuses.

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Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Cette vidéo montre le test de complémentation de la luciférase fractionnée pour détecter les interactions protéine-protéine. Dans cet essai, les protéines d’intérêt sont associées à de petits et de grands fragments de l’enzyme luciférase. Lorsque les protéines interagissent, les grands et les petits fragments se combinent pour former un complexe enzymatique actif, qui, en présence d’un substrat spécifique, libère une luminescence brillante qui peut être mesurée.

Essai de complémentation de la luciférase fractionnée pour identifier des interactions protéine-protéine spécifiques

La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA...

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Le protocole présenté ici vise à démontrer l’apparition d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et les N- et/ou C-termini exposées cytoplasmiquement dans des cellules de mammifères vivants en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée.

Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction, et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans Nicotiana benthamiana. Ce protocole peut être étendu à la purification et à la visualisation de nombreuses protéines qui utilisent la chromatographie des colonnes. De plus, le protocole s’adapte au laboratoire d’enseignement collégial virtuel et en personne, offrant une exploration axée sur des projets.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

Nous présentons ici une méthode pour visualiser la formation de complexes ternaires entre trois partenaires protéiques à l’aide de protéines marquées par fluorescence par le test FRET-FLIM basé sur BiFC. Cette méthode est précieuse pour étudier les complexes d’interaction protéine-protéine in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

Ce protocole décrit la sélection de marqueurs plasmodesmaux optimaux pour les analyses basées sur la microscopie confocale du ciblage des protéines sur les plasmodesmes lors d’interactions virus-plasmodesmes ou de transport plasmodesmal.

Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana

Découvrez une méthode rapide d'analyse de complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour quantifier les interactions protéine-protéine en biologie cellulaire.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

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