Une méthode de culture mixte d’enquêter sur les interférences entre les rayons x irradiés PBMC et cellules Caco-2

L’objectif général de ce protocole de coculture est de mesurer les effets des rayonnements ionisants sur la perméabilité monocouche des cellules épithéliales Caco-2 et la fonction des jonctions serrées en présence ou en l’absence de cellules mononucléées du sang périphérique. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans les domaines de la radiobiologie et de la radio-immunothérapie sur les effets synergiques possibles entre l’exposition aux rayonnements ionisants et les fonctions des cellules immunitaires. Les principaux avantages de cette technique sont que différents stimuli et populations cellulaires peuvent être testés et que des phénomènes observés peuvent être découplés par des mesures complémentaires ad hoc.

Les procédures de radiothérapie visent à considérer la monocouche de cellules Caco-2 car le volume de la tumeur est irradié avec le faisceau approprié et une dosimétrie précise comme c’est le cas de la radiothérapie chez le patient. Une semaine avant leur irradiation, ensemencez cinq fois 10 à la cinquième cellules Caco-2 dans deux millilitres de milieu complet dans un insert de culture cellulaire stérile d’un micromètre de diamètre de pore par puits dans une plaque de culture cellulaire à six puits. Ajoutez trois millilitres de milieu complet frais dans le compartiment inférieur de chaque puits et placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant sept jours.

Le dernier jour de l’incubation, ajoutez 25 millilitres de Ficoll dans un tube conique de 50 millilitres. Et superposez soigneusement 25 millilitres de sang total fraîchement collecté sur le Ficoll. Séparez les cellules par centrifugation par gradient de densité.

Et utilisez une pipette Pasteur pour transférer les cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMC à l’interface dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Lavez ensuite le PBMC isolé en deux lavages PBS de 10 millilitres. Et cultivez le PBMC dans un milieu frais complet pendant pas plus de trois à cinq heures dans l’incubateur de culture cellulaire.

Réglez l’énergie des rayons X des photons sur un pic de six mégavolts. Et placez la culture cellulaire Caco-2 sur une feuille de plexiglas de 1,4 centimètre d’épaisseur dans la trajectoire des rayons X et à 100 centimètres de la source de rayonnement. Placez ensuite un bolus de 0,57 centimètre d’épaisseur sur chaque échantillon pour garantir l’équilibre de la composante de rayonnement rétrodiffusée et des particules chargées.

Et utilisez un champ de rayonnement plat et symétrique de 20 centimètres carrés sur 20 et un débit de dose de trois gris par minute pour irradier les cellules. Pour évaluer l’activité métabolique et la viabilité des cellules Caco-2, ensemencez deux fois 10 à cinq cellules Caco-2 dans chaque puits d’une plaque de 24 puits 24 heures avant leur irradiation dans 1,25 millilitre de milieu complet. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 21 heures.

Le lendemain, ajoutez 100 microlitres de cinq milligrammes par millilitre de solution MTT dans chaque puits et incubez les cellules pendant trois heures supplémentaires. Après avoir lavé les cellules avec un millilitre de PBS, ajoutez 500 microlitres de diméthylsulfoxyde dans chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan libérés par les cellules Caco-2 et évaluez l’absorbance avec un lecteur de plaques multi-puits à un lambda de 570 nanomètres. Pour évaluer la viabilité des cellules Caco-2, laver les cellules avec un millilitre de PBS par puits, puis les détacher avec 100 microlitres de solution de trypsine-EDTA pendant deux minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Arrêtez la réaction avec 500 microlitres de milieu complet et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 50 microlitres de PBS par tube et mélangez les suspensions cellulaires résultantes avec un volume égal de solution de colorant de viabilité Trypan Blue. Après trois minutes à température ambiante, comptez le nombre de cellules viables non colorées et non viables dans l’hémocytomètre.

Pour évaluer la résistance électrique transépithéliale ou TEER des cellules Caco-2, immédiatement après le transfert d’irradiation, la moitié des inserts de culture cellulaire Caco-2 dans une nouvelle plaque avec trois millilitres de milieu complet frais dans chaque puits et la moitié des cultures d’insertion dans une nouvelle plaque ensemencée de deux fois 10 à la sixième PBMC par trois millilitres de milieu complet par puits. Ensuite, placez une électrode de baguette TEER dans l’insert de culture cellulaire toutes les heures pendant les six premières heures, puis toutes les trois heures jusqu’à 48 heures après l’irradiation. Pour l’analyse par Western blot, 48 heures après leur irradiation, lyse les cellules Caco-2 et PBMC avec 40 microlitres par un fois 10 à la sixième cellule du tampon de lyse cellulaire.

Lors de la lyse et du grattage des cellules Caco-2, veillez à ne pas détacher la membrane poreuse de l’insert, ce qui peut entraîner une perte de lysat cellulaire et un résultat biaisé. Conservez les échantillons de cellules lysées à moins 20 degrés Celsius. Après avoir quantifié la quantité totale de protéines dans chaque échantillon de lyse cellulaire par la méthode de l’acide bicinchoninique, ajoutez des volumes égaux de tampon d’échantillon Laemmli complété par du bêta-mercaptoéthanol à chaque échantillon de protéines totales dans des tubes de microcentrifugation individuels.

Chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, collectez les protéines dénaturées par centrifugation et chargez des volumes totaux de protéines égaux de chaque échantillon dans un gel prémoulé à quatre à 20 %. Analysez les échantillons pendant une heure à 120 volts.

Ensuite, utilisez un système de transfert électrique semi-sec pour transférer les protéines sur une membrane de fluorure de polyvinylidène. Ensuite, placez la membrane dans un récipient et bloquez les sites de liaison non spécifiques avec 5 % de lait écrémé en poudre dans du PBS complété par 0,2 % de Tween 20 pendant 60 minutes à température ambiante avec une agitation douce. À la fin de l’incubation bloquante, laver la membrane trois fois avec 10 millilitres de PBS Tween 20 à 0,2 % pendant cinq minutes par lavage et étiqueter la membrane avec les anticorps primaires d’intérêt appropriés pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce.

Après une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius avec une agitation douce, laver la membrane trois fois avec 0,2 % de PBS Tween 20 comme cela vient d’être démontré et incuber la membrane avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort appropriée pendant 60 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Après trois lavages PBS, incubez la membrane avec un kit de solution chimiluminescente améliorée. Ensuite, imagez le film obtenu avec un système de balayage approprié et quantifiez les résultats avec un programme d’analyse d’image approprié.

L’irradiation jusqu’à 10 grays ne modifie pas l’activité métabolique des cellules Caco-2 24 ou 48 heures après l’irradiation, bien que la viabilité cellulaire diminue avec le temps aux deux doses. L’évaluation TEER des cellules Caco-2 non cocultivées après exposition à deux gris d’irradiation révèle des valeurs TEER constantes jusqu’à 48 heures après l’irradiation. Après 10 gris d’irradiation, cependant, les cellules présentent une diminution prolongée de TEER à partir de trois heures après l’irradiation.

La coculture avec des PBMC entraîne une réduction de la TEER qui est évidente de trois heures après l’irradiation aux deux doses jusqu’à 30 heures après l’irradiation, moment où les valeurs de la TEER semblent rester relativement constantes. L’analyse par transfert Western des protéines de jonction serrée ne révèle aucune différence dans l’expression de Claudin-1 ou d’Occludin en réponse à l’irradiation et/ou à la coculture PBMC, tandis que de grandes fluctuations sont observées dans diverses protéines d’échafaudage. De plus, la protéine totale NF-kappa B n’est affectée à aucune des doses d’irradiation, tandis que les niveaux de protéine XIAP sont régulés à la hausse par quatre aux deux doses.

En utilisant cette procédure, d’autres stimuli biologiques comme les entérobactéries peuvent être ajoutés pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont différents stimuli biologiques peuvent modifier la réponse de la bonne monocouche à l’exposition aux rayonnements ionisants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’impact des rayonnements ionisants et des cellules immunitaires sur la perméabilité des cellules Caco-2 et l’expression du complexe des jonctions serrées.