Name: Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez l'expression transitoire dans Nicotiana benthamiana pour la production de triterpènes à l'échelle préparatoire. Cette méthode rapide permet de détourner le 2,3-oxidosqualène vers des composés d'intérêt pharmaceutique.

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Ce travail a été soutenu par une bourse d’étude de parc recherche (JR) Norwich, l’ingénierie commune et les Sciences physiques recherche Conseil/issus de la biotechnologie et les Biological Sciences Research Council BBSRC OpenPlant synthétique Biology Research Centre, financé par subventions (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.) ; a John Innes Centre d’échange de connaissances et de la commercialisation accordent (BB/KEC1740/1) (B.B.) ; et l’octroi de Programme stratégique BBSRC Institute « Molécules de Nature » (BB/P012523/1) et le John Innes Foundation (e.a.). Nous tenons à remercier George Lomonossoff pour fournir les vecteurs pEAQ et Andrew Davis pour la photographie.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Haut-par-put infiltration sous vide permet de ce protocole à être utilisés en routine dans notre laboratoire de production préparative de triterpène composés d’intérêt pour diverses applications en aval. L’appareil d’infiltration sous vide décrit ici est reproduit facilement. Ajout du réservoir vide est conseillé pour diminuer le temps nécessaire pour tirer le vide nécessaire, cependant il est possible de simplement réutiliser une étuve à vide non modifiée comme la chambre de l’infiltration. Protection de la pompe à vide via l’ajout d’un condensateur adapté est théoriquement sensé, mais dans notre laboratoire, nous avons trouvé cela inutile.
Couverture de l’infiltration est compromise si les feuilles ne sont pas complètement immergés dans la suspension de l’infiltration. Ce problème est réduit en s’assurant que le niveau de la suspension atteint la surface supérieure du titulaire de la plante, et que le titulaire de la plante est un ajustement serré pour le bain d’infiltration. Figure 2, Notez que la surface supérieure du titulaire de la plante est en retrait dans à la baignoire de l’infiltration dans cette position. Ceci est réalisé en panneaux sur les bords moyens du titulaire qui constituent le point d’ancrage au dessus de la baignoire de l’infiltration. La suspension d’infiltration exigera des ajouts périodiques pour maintenir le niveau de la suspension. Ceci est mieux réalisé par addition de suspension infiltration excessive pour empêcher la réduction progressive de l' OD600 au cours d’une infiltration avec grand. Toutefois, dans nos mains, substitution de l’eau ne semble pas avoir un effet notable sur les rendements attendus à l’échelle préparative, bien que cela n’a pas été quantitativement étudiée. Combien de plantes peut être infiltré d’un lot de suspension de l’infiltration est toujours une question ouverte. Nous infiltrent régulièrement entre 100 et 200 plantes avec un lot unique de suspension de l’infiltration. En outre, il est normal que certains sols de lixivier dans la suspension d’infiltration au cours du processus d’infiltration. Cela n’a pas été trouvé pour avoir un effet notable sur l’efficacité de l’infiltration.
Au cours de la récolte, il est conseillé (mais pas critique) à récolter uniquement les feuilles qui ont été infiltrés (quelques feuilles aura atteint après infiltrations). La récolte sélective empêche la dilution avec tissu improductif, qui serait sinon augmenter le taux d’impuretés endogènes par rapport au composé d’intérêt. Cela a un impact nominal sur la facilité de la purification en aval et augmente l’échelle de ces processus. Lorsque vous utilisez tHMGR pour alimentation en précurseur de Poussée, un phénotype nécrosée est souvent observé à développer au cours de la période de croissance après infiltration. Ceci est normal et en fait du sida récolte sélective et le processus de séchage en aval. La poudre de feuilles séchées peut généralement être stockée dans un conteneur scellé dans un endroit frais, sec et sombre, mais idéalement dans un dessicateur sous vide. Cela dépend de la stabilité du composé d’intérêt. Soyez prudent si vous choisissez de stocker dans un congélateur à-80 ° C. Veiller à ce que les séché les feuilles sont dans un conteneur étanche et le déstockage, permettre ce conteneur se réchauffer à température ambiante avant ouverture. Faute de quoi se traduira par la réhumidification des feuilles, qui entravent le traitement en aval.
Les étapes après la récolte dans le présent protocole sont fournies à titre indicatif, et afin d’aider les chercheurs qui ont une chimie pratique limitée d’expérience. Ils peuvent se substituer à plusieurs autres techniques d’extraction/purification de produits naturels. Comme indiqué dans l’introduction, PSE présente de nombreux avantages, cependant l’amortissement des appareils disponibles dans le commerce de PSE peut être prohibitif et il n’est pas essentiel. Traitement de résine échangeuse d’ions base est une méthode très pratique pour remplacer la saponification traditionnelle suivie par séparation liquide/liquide. Toutefois, il ne convient pas pour les produits contenant de l’acide carboxylique groupes ou groupes fonctionnels qui serait être hydrolysés dans des conditions basiques, tels que les esters. Ces produits devrait être conservée sur l’échangeur de base. Toutefois, il est possible d’utiliser ce dernier pour une capture et de libérer la procédure (non documentée ici). Lorsque la saponification traditionnelle serait appropriée, traitement de résine échangeuse d’ions base sert une alternative commode. La méthode de chromatographie décrite à l’étape 9, s’est avéré pour être généralisables pour les composés décrits à la Figure 3. Toutefois, les composés de polarité accrue peuvent nécessiter une longue période d’élution 100 % pour l’acétate d’éthyle. En ce qui concerne l’étape 9.2, purification fine en aval est entièrement composé spécifique et est aussi dépendante de l’échelle. Rondes répétées de chromatographie flash plus petite échelle avec des gradients optimisées, est habituellement suffisante pour atteindre une pureté appropriée pour analyse par RMN. Sur des échelles plus larges, la cristallisation est souvent une alternative commode. Dans les cas difficiles, préparative ou semi-préparative chromatographie liquide haute performance (CLHP) peut être employée selon la quantité désirée de composé isolé. Exemples de procédés de purification en aval pour une gamme de composés représentatifs peuvent être trouvés ailleurs8.
Le protocole actuel, tel que présenté ici, est utilisé régulièrement dans notre laboratoire et a prouvé utilitaire. Cependant, il y a encore importante portée pour l’optimisation de la plate-forme d’expression supplémentaire. Travaux sont en cours dans notre laboratoire pour étudier comment autre génie de voie et différentielle contrôle des niveaux d’expression de protéine pourrait améliorer la production de triterpène davantage, tandis que la médiation de toxicité pour les cellules de l’hôte. Il y a aussi potentiel d’enquêter sur la manipulation des systèmes de transport intracellulaire20,21et la direction d’enzymes pour différents compartiments cellulaires22,23, les avenues qui pourraient améliorer l’efficacité de plusieurs événements de l’oxydation. Les avantages potentiels à la modification de la morphologie sous-jacente des organelles clés pourraient également être explorées. Par exemple, la surexpression du domaine membranaire de Arabidopsis thaliana HMGR a été observée pour induire une hypertrophie du réticulum endoplasmique dans les plantes24; un site clé pour l’activité CYP450. Ce protocole est idéal pour la production de milligramme de quantités de produits de triterpène gramme et peut être utilisé dans un contexte de recherche pour accéder aux composés pour étude en aval (par exemple, l’exploration systématique de structure-activité relations et enquête préliminaire dans les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques de plomb composés d’intérêt clinique). Toutefois, la plate-forme est linéairement et fiable évolutif simplement en augmentant le nombre des plantes utilisées et l’aspect pratique d’expression transitoire via agroinfiltration a été démontré à l’échelle industrielle pour la production de protéines pharmaceutiques 14, donc il est possible pour cette plate-forme pour être prolongée pour la production commerciale de triterpènes de grande valeur. Alternativement, il est aussi possible d’envisager la production de transformants stables transportant la voie de biosynthèse multigénique désir finalisés, permettant la culture de masse et continue « agriculture » de transgéniques N. benthamiana souches production de différents composés d’une valeur commerciale.

Les triterpènes sont parmi les plus importantes et la plupart des structures diverses familles des produits naturels. Malgré leur immense diversité, tous les produits naturels de triterpène sont censés provenir de la même précurseur linéaire 2,3-oxidosqualene, un produit de la voie du mévalonate dans les plantes. La cyclisation des 2, 3-oxidosqualene est initiée et contrôlée par une famille d’enzymes appelées oxidosqualene cyclases (OSC). Cette étape de cyclisation représente le premier niveau de diversification, avec des centaines de triterpène différents échafaudages ayant été signalés dans la nature1. Ces échafaudages sont plus diversifiés en adaptant les enzymes y compris, mais non limité à, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Ces voies de biosynthèse peuvent conduire à immense complexité, entraînant parfois des produits finis qui sont à peine reconnaissables depuis le triterpène de parent. Par exemple, la structure complexe de la puissant insecticide et antiappétant limonoïde azadirachtin est censée provenir d’un triterpène tétracyclique des tirucallane type3.
Nombreux dérivés triterpéniques produits naturels, même ceux avec les échafaudages parent relativement non modifiés, ont démontré en médecine des activités biologiques4,5,6,7. Toutefois, jusqu'à présent ce potentiel n’est pas traduite par une pléthore de médicaments dérivés triterpéniques à la clinique. Il s’agit sans aucun doute (au moins partiellement) une conséquence de l’accès limité de synthèse pratique pour cette classe de composés, un problème qui peut étouffer l’exploration des relations structure-activité et mise au point de conduire candidats par traditionnel médicinales workflows de chimie.
Expression transitoire des enzymes biosynthétiques triterpène d’autres espèces végétales dans les feuilles de N. benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène (Figure 1). Ce processus peut servir à caractériser sur le plan fonctionnel les enzymes candidat et reconstruire les voies de biosynthèse des métabolites naturels importants. De même, il peut également être exploitée dans des approches de biosynthèse combinatoires triterpène de nouveaux produits, une stratégie qui peut se traduire par des bibliothèques des analogues de structure apparentées, permettant une exploration systématique des relations structure-activité de plomb biologiquement actif composés de8,9.
Agroinfiltration est un moyen simple et efficace de réaliser l’expression transitoire dans les feuilles de N. benthamiana . Le processus implique l’infiltration des feuilles avec une suspension de a. tumefaciens transportant les exigences d’une expression binaire d’intérêt. Ceci est réalisé via l’application d’une pression qui force le liquide à travers les stomates, déplacement de l’air dans l’espace intercellulaire et son remplacement par la suspension d’a. tumefaciens . Les bactéries transférer l’ADN-T respectifs à l’intérieur des cellules végétales, aboutissant à l’expression de la protéine passagères et localisée dans les tissus foliaires infiltrés.
Tout en n’importe quel vecteur binaire adapté pour générer des plantes transgéniques peut-être être employée pour l’expression transitoire, nous utilisons le niébé Mosaic Virus CPMV dérivé Hypertranslational (HT) protein expression système10, 11. dans ce système, le gène d’intérêt est flanqué de régions non traduites (UTR) de l’ARN-2 CPMV. La 5' UTR contient des modifications entraînant des niveaux très élevés de la traduction des protéines avec aucun recours à la réplication virale,12. Cette technique a été développée dans la série de vecteur binaire Easy-et-rapide (ÉPQL) qui comprend la recombinaison site-spécifique clonage Protocole compatible constructions (ÉPQL -HT- DEST)10,11. La plupart des vecteurs pEAQ contiennent aussi une tomate bushy stunt virus dérivés P19 silencieux suppresseur gène13 dans la partie de l’ADN-T de la cassette d’expression, qui contourne qu’il fallait coinfiltrate une souche P19 porteurs distincte et offre très expression de la protéine de haut niveau chez l’hôte plant cell10,11.
Utilisation de N. benthamiana comme un hôte d’expressions présente des avantages particuliers lorsqu’il travaille avec voies de biosynthèse de plante. L’architecture cellulaire intrinsèquement prend en charge que les ARNm approprié et transformation de la protéine et cloisonnement approprié, en plus de posséder les enzymes nécessaires de co, réductases (pour CYP450s) et précurseurs métaboliques. La source de carbone est la photosynthèse ; ainsi, les plantes peuvent simplement être cultivées dans le compost de bonne qualité, nécessitant uniquement eau, CO2 (à partir de l’air) et le soleil comme entrées. La plateforme est également très pratique pour la co-expression de différentes combinaisons de protéines, comme cela peut se faire simpliste par l’infiltration Co de différentes souches de a. tumefaciens, niant la nécessité de construire la grande expression multigénique cassettes. En outre, le processus peut linéairement et sûrement évoluer simplement en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l’expérience.
Des travaux précédents dans notre laboratoire a démontré l’utilité de cette plateforme pour des expériences à échelle préparative. Ceci inclus la préparation de nouveaux triterpènes pour essais de bioactivité et échelle vers le haut pour atteindre les quantités de gramme de produit isolé. En outre, l’accumulation de produits hétérogènes triterpène peut être augmentée plusieurs fois par la co-expression de forme N-terminal-tronqué, indépendante de la rétroaction de l’hydroxy-3, 3-methyglutary-coenzyme A réductase (tHMGR), une limitation de vitesse en amont enzyme dans la voie de mevalonate8.
Clé de telles expériences échelle préparative est la capacité de bien haut de gamme le processus d’infiltration. Dans une expérience typique, des dizaines ou des centaines de plantes peuvent être nécessaire pour atteindre la quantité cible de produit isolé. S’infiltrer dans des feuilles individuelles à la main (à l’aide d’une seringue inutile) est exigeante sur le plan opérationnel et souvent trop longues, rendant cette méthode impraticable pour l’intensification systématique. Infiltration sous vide offre des avantages par infiltration de la main, car il ne dépend pas du niveau de compétence de l’opérateur et permet l’infiltration d’une surface plus grande de la surface foliaire. Cette procédure est utilisée commercialement pour la production à grande échelle des protéines pharmaceutiques14. Ce protocole utilise un appareil facile à reproduire infiltration sous vide, qui peut être construit à partir des pièces disponibles dans le commerce. Cela permet l’infiltration simultanée de jusqu'à 4 plantes, offrant rapide et pratique avec infiltration de centaines de plantes dans un court laps de temps (Figure 2 a -2 b). L’appareil d’infiltration sous vide est constitué d’un four sous vide qui constitue la chambre de l’infiltration (Figure 2f). Le four est relié à une pompe via un réservoir vide. Ceci réduit considérablement le temps nécessaire pour atteindre le vide désiré dans la chambre de l’infiltration. Plantes sont sécurisés dans un support sur mesure et inversés dans un bain d’eau en acier inoxydable de 10 L rempli d’a. tumefaciens suspension (Figure 2 a -2C). Immersion complète des parties aériennes des plantes est importante pour l’infiltration efficace. L’eau du bain est alors placé dans la chambre de l’infiltration (Figure 2d -2e) et le vide appliqué pour dessiner l’air dans les espaces interstitiels de la feuille. Une fois que la pression a été réduite de 880 mbar (un processus qui prend environ 1 min) la chambre de l’infiltration est ramenée rapidement à la pression atmosphérique 20-30 s en ouvrant la vanne d’entrée du four, après quoi l’infiltration est terminée.
Cinq jours après l’infiltration le matériel végétal est prêt pour l’extraction ultérieure et de récolte et d’isolation du produit désiré. De ce point, le processus est tout simplement un des produit naturel extraction et purification de matériel foliaire, un flux de travail qui est familière à un chimiste de produit naturel. 15il existe différentes méthodes pour l’extraction initiale et purification ultérieure. Le choix le plus approprié des méthodes et les conditions exactes utilisées dépend fortement les propriétés chimiques particulières du composé d’intérêt, en plus de la disponibilité de compétences et/ou de matériel. Il n’est pas possible d’inclure dans le présent protocole, une méthode totalement généralisable, étape par étape pour la transformation en aval de matériel foliaire des plantes récoltées au produit isolé qui pourrait être suivi aveuglément pour n’importe quel produit de triterpène d’intérêt, ne serait pas approprié tenter de le faire. Toutefois, ce protocole donnera un aperçu du flux de base utilisé dans notre laboratoire et certaines méthodes pour les premiers stades du processus, qui, selon notre expérience, sont sont avérés généralisables pour produits de triterpène aglycone plus oxygénés. Cela inclut deux techniques relativement rares, nommément Pressurized Solvent Extraction (PSE) et une méthode en phase hétérogène commode pour l’enlèvement de la chlorophylle à l’aide d’une résine échangeuse d’ions fortement basiques.
PSE est une technique très efficace pour l’extraction de petites molécules organiques des matrices solides. Les extractions sont effectuées sous pression (env. 100-200 bar), le principal avantage est la possibilité d’utiliser allégé des températures excédant l’ébullition point du solvant d’extraction. Cela peut réduire considérablement le temps et la quantité de solvant nécessaire pour obtenir une extraction exhaustive, par rapport aux autres techniques de solvants chauds comme simple reflux ou Soxhlet extractions16. Instruments de PSE-comptoir commerciales sont disponibles, qui utilisent des cellules interchangeables extraction et solvant automatisé de manipulation, de chauffage et surveillance. Ce qui rend cette technique extrêmement pratique. C’est aussi sans doute moins dangereux, en particulier pour les opérateurs ayant une expérience de chimie pratique limitée.
Saponification des extraits de feuilles brutes sous reflux suivie de séparation liquide/liquide est une technique courante pour les prélèvements massifs des chlorophylles avant purification ultérieure ou d’analyse. Toutefois, cela peut souvent être opérationnel exigeant sur plus grandes échelles. En outre, la détection de l’interface, ou la perte de produit dû à la formation d’émulsions peut être problématique. L’utilisation de résines échangeuses d’ions fortement basiques pour effectuer l’hydrolyse phase hétérogène peut constituer une alternative commode. La partie pigmentée de la chlorophylle hydrolysée reste collée à la résine et peut être simplement éliminée par filtration. Ce protocole utilise une adaptation de l’échelle préparative d’une procédure analytique précédemment rapporté17 qui utilise une résine échangeuse d’ions base disponible dans le commerce.
Ci-dessous, nous décrivons un protocole détaillé et rapid pour la production de l’échelle préparative de triterpènes utilisant cette plate-forme à base de plantes. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour préparer des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit triterpéniques isolés pour applications une telle caractérisation par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), et/ou approfondir dans fonctionnel dosages.

<table><tbody><tr><td>Instrument GC-MS</td><td>tout</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur adapté à la réalisation de réactions PCR</td> tout <td>n/a</td><td></td>Appareil <td>d’électrophorèse</td></tr> sur <tr><td>gel</td><td>n’importe quel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes à déplacement d’air réglables (Tailles : 1000 & micro ; L, 200 et micro ; L, 100 et micro ; L, 20 et micro ; L, 10 et micro ; L, et 2 & micro ; L )</td><td>n’importe</td><td></td> <td>quel</td></tr><tr><td>vecteur d’azote liquide large (taille : 2 L)</td><td>n’importe quelle</td><td></td> microcentrifugeuse de paillasse n/a <td></td></tr><tr><td>(capacité : 24 x 1,5/2 mL, vitesse max. : =/> 15000 tr/min)</td><td>n/</td>a Centrifugeuse de paillasse n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>(capacité : 20 x 50 mL, vitesse max. : =/> 4000 tr/min)</td><td>n/</td><td>a</td><td></td></tr><tr><td>Grande centrifugeuse au sol (capacité : 4 x 1L, vitesse max. : =/> 4000 tr/min)</td><td>tout</td><td>s.o</td><td></td></tr><tr><td>. Incubateur sur pied</td><td>tout</td><td>s.o</td><td></td></tr>. <tr><td>Incubateur à secousses (flasque Tailles : 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>n’importe lequel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à centrifuger (1 L)</td><td>n’importe lequel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’infiltration sous vide</td><td>sur mesure</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pots de fleurs de 9 x 9 cm</td><td>tout s.o</td><td></td><td></td></tr><tr><td>.Appareil de lyophilisation (=/> capacité du condenseur de 8 litres)</td><td>n’importe</td><td></td> <td>quel</td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 avec cellules d’extraction de 120 mL (instrument PSE)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’évaporation rotatif</td> n<td>/a n/a</td><td></td>Flacons <td>d’évaporation (</td></tr><tr><td>Tailles : 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>n’importe</td><td></td> <td>quel</td> flacon</tr><tr><td>Duran (Tailles : 1 L, 10 L)</td><td>n</td><td>/ a</td><td></td></tr><tr><td>Fioles coniques (formats 100 mL, 2 L)</td><td>n’importe</td><td></td> <td>quelle</td></tr><tr><td>spatule (tailles assorties)</td><td>n’importe laquelle</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique (5 chiffres)</td><td>n’importe laquelle</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>n</td><td>/a N/a</td><td></td></tr><tr><td>Cylindres doseurs (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>n’importe quel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 congélateur</td><td>tout</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Biotage Isolera avec support de collecte de 250 ml et flacons (instrument automatisé de chromatographie flash</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de sécurité</td><td>tout</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Blouse de laboratoire</td><td>n</td><td>/a n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>n</td>/<td>a</td><td></td></tr><tr><td>Conssommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette (Tailles : 1000 & micro ; L, 200 et micro ; L, 100 et micro ; L, 20 et micro ; L, 10 et micro ; L, et 2 & micro ; L )</td><td>n’importe</td><td></td>quel <td>s.o</td></tr>. <tr><td>Tubes de microcentrifugation (Taille : 2 mL)</td><td>n’importe</td><td></td>quel <td>s.o</td></tr>. <tr><td>Tubes à centrifuger (Tailles : 15 mL, 50 mL)</td><td>n’importe</td><td></td>quel <td>s.o</td></tr>. <tr><td>Pipettes de transfert jetables (taille 2 mL)</td><td>n</td><td>/a</td> Boîtes de Pétri (Format : 100 mL)n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg ; SNAP KP-SIL cartouches flash 100 g</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>Flacons HPLC (1 mL), inserts et bouchons de flacons</td><td>tout</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gants jetables en nitrile violet</td><td>n’importe quel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filtre supérieur pour E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Filtre inférieur pour E-916 / 914, fibre de verre</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><fort> Réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sable de quartz, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Célite 545 (terre de diatomées)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silice 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1,09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)-éthanesulfonique</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-diméthoxy-4'-acétophénone (acétosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep® ; &nbsp ; 900 hydroxyde (résine échangeuse d’ions basiques)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Eau</td><td>n’importe quel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>n</td><td>/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>n’importe quel</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (kit de purification de plasmide).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Fournisseur New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vecteur</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (protocole de clonage par recombinaison spécifique au site)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protocole de clonage par recombinaison spécifique au site)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMÉRASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Système de synthèse premier brin</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana graines de benthamia</td><td>tout fournisseur de bonne réputation</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

expression transitoire de nicotiana benthamiana quitte pour triterpène production à l’échelle préparative

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Les triterpènes sont parmi les plus importantes et la plupart des structures diverses familles des produits naturels. De nombreux dérivés triterpéniques montrent possèdent une activité biologique en médecine pertinente. Toutefois, jusqu'à présent ce potentiel n’est pas traduite par une pléthore de médicaments dérivés triterpéniques à la clinique. Il s’agit sans aucun doute (au moins partiellement) une conséquence de l’accès limité de synthèse pratique pour cette classe de composés, un problème qui peut étouffer l’exploration des relations structure-activité et mise au point de conduire candidats par traditionnel médicinales workflows de chimie. Malgré leur immense diversité, triterpènes sont tous dérivés d’un seul précurseur linéaire, 2, 3-oxidosqualene. L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans N. benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de triterpène de grande valeur qui ne sont pas naturellement produites par cet hôte. Il y a un moyen simple et efficace de réaliser l’expression transitoire dans N. benthamianaagro-infiltration. Le processus implique l’infiltration des feuilles de la plante avec une suspension d' Agrobacterium tumefaciens transportant les exigences d’expression d’intérêt. Co l’infiltration d’une supplémentaire a. tumefaciens souche transportant une construction expression codant une enzyme qui augmente la fourniture précurseur sensiblement augmente les rendements. Après une période de cinq jours, le matériel infiltrés feuilles peut être récolté et transformé pour extraire et isoler l’ou les produits qui en résultent triterpène. Il s’agit d’un processus qui est fiable et linéairement évolutif, simplement en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l’expérience. Ici est décrit un protocole pour la production rapide d’échelle préparative des triterpènes utilisant cette plate-forme à base de plantes. Le protocole utilise un appareil facile à reproduire infiltration sous vide, qui permet l’infiltration simultanée de jusqu'à quatre usines, ce qui permet une infiltration avec des centaines de plantes dans un court laps de temps.

Les rendements isolés typiques dépendent de la combinaison d’enzyme/enzymes sous enquête, la stabilité chimique du composé cible et comment contester le processus de purification a été. Nous avons déjà rapporté des rendements isolés de β-amyrine dérivés de nos expériences de biosynthèse combinatoire variant de 0,12 à 3,87 mg par gramme de poudre de feuilles de N. benthamiana à sec. Ces composés variaient grandement dans le niveau d’oxydation et inclus des combinaisons non naturels d’enzymes (Figure 3)8. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour produire des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit purifié pour la caractérisation par spectroscopie RMN et essais fonctionnels en aval. Nous avons aussi démontré l’utilité préparative de cette plate-forme de production de 0,8 g de l’échafaudage de triterpène β-amyrine à une pureté supérieure à 98 %. Cette expérience utilisé 459 plantes et représente un rendement isolé de 3,3 mg par gramme de sec N. benthamiana feuille poudre8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figure 1 : Résumé schématique. Représentation schématique du processus exploitant l’expression transitoire des enzymes biosynthétiques dans N. benthamiana feuille de détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production préparative de nouveaux produits de haute valeur triterpène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figure 2 : vide construction infiltré et processus. un) Ad hoc plante porte une aile détachée. b) Bespoke plante porte aile. c) Inversion et la submersion des plantes. d) d’Insertion de la baignoire de l’infiltration. e) Infiltration bain en place au sein de la chambre de l’infiltration. f) Complete infiltré sous vide : pompe à vide (1) (2) raccordement de pompe à vide à vanne aspiration réservoir vide (3) réservoir (4) la connexion entre le réservoir vide et la soupape d’admission infiltration chambre Air (5) Manomètre (6) (7) Réservoir de vide infiltration chambre (8). g) représentant les feuilles d’une plante infiltrée par une construction de l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) après cinq jours après l’infiltration de croissance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figure 3 : signalé auparavant des résultats représentatifs pour la production préparative de β-amyrine dérivés utilisant ce protocole8. Ce tableau est trié par rendements isolés. Les colonnes sont conditionnellement formatés avec indication de la couleur de la valeur relative. Rouge = haut, vert = low (jaune bien intermédiaire). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Ce protocole offre un accès pratique à l’échelle préparative aux composés triterpéniques pour une utilisation dans des études en aval, telles que la caractérisation structurelle ou l’expiration d’une activité biologique pertinente sur le plan médical. Le protocole est rapide, évolutif et permet d’utiliser des combinaisons d’enzymes simplement par la co-infiltration de différentes souches d’Agrobacterium, éliminant ainsi la nécessité de construire de grands vecteurs multigéniques. Pour commencer, inoculez une plaque de gélose LB sélective avec des stries des souches d’Agrobacterium tumefaciens souhaitées à partir de cultures mères de glycérol.Incuber la plaque pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur sur pied. Le lendemain, inoculer individuellement 50 millilitres de milieu sélectif LB avec un échantillon de chaque souche d’Agrobacterium tumefaciens. Incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur à secouer à 200 tr/min.Transférez individuellement les cultures de 50 millilitres dans 1 000 millilitres de milieu LB sélectif et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius dans l’incubateur à agitation à 200 tr/min. Le lendemain, granulez individuellement l’Agrobacterium tumefaciens des cultures liquides par centrifugation à 4 000 fois g. Après avoir jeté le surnageant, remettez individuellement les granulés en suspension dans 50 millilitres de tampon MMA fraîchement préparé.Incuber les granulés remis en suspension à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Maintenant, déterminez le volume approprié de chaque suspension d’Agrobacterium tumefaciens MMA pour produire une DO 600 finale d’au moins 0,2 dans un volume final total de 10 litres. Combinez les volumes déterminés de chaque suspension.Maintenant, ajoutez un tampon MMA supplémentaire aux suspensions combinées jusqu’à un volume final d’un litre, à utiliser immédiatement pour l’infiltration du vide. Transférez le litre de suspension d’infiltration et le litre de tampon MMA 10x dans le bain d’infiltration, suivis de huit litres d’eau supplémentaires. Retirez les ailes amovibles du porte-plante sur mesure.Insérez quatre plantes de cinq semaines qui ont été cultivées comme décrit dans le protocole de texte, et rattachez les ailes. La couverture d’infiltration est compromise si les feuilles ne sont pas complètement immergées dans la suspension d’infiltration. Ce problème est minimisé en s’assurant que le niveau de la suspension atteint la surface supérieure du support de plante avant le traitement sous vide.Retournez le support et placez-le sur le bain d’infiltration de manière à immerger les feuilles dans la suspension d’infiltration. Transférez le bain d’infiltration avec les plantes immergées dans la chambre d’infiltration et fermez la porte. Assurez-vous que la soupape d’admission d’air est fermée sur l’infiltrateur.Après avoir allumé la pompe à vide, ouvrez la soupape d’admission de vide sur la chambre d’infiltration. Une fois que la pression dans la chambre d’infiltration a diminué de 880 millibars, fermez la soupape d’admission à vide et ouvrez la soupape d’admission d’air. De retour à la pression atmosphérique, ouvrez la porte et retirez le bain d’infiltration.Maintenant, soulevez le porte-plantes jusqu’à ce que les plantes ne soient plus immergées dans la suspension d’infiltration. Ensuite, secouez doucement le support pour permettre à l’excès de suspension de s’écouler des feuilles et de retourner dans le bain d’infiltration. Enfin, remettez le support en position verticale, retirez les ailes amovibles et retirez les plantes.Cultivez les plantes infiltrées pendant cinq jours à 25 degrés Celsius en 16 heures par jour de lumière avec un arrosage quotidien. Après cinq jours de croissance, récoltez les feuilles, puis séchez-les comme décrit dans le protocole textuel. Broyez les feuilles séchées en une poudre grossière à l’aide d’une méthode pratique, comme l’utilisation d’un robot culinaire domestique ou l’écrasement manuel des feuilles lorsqu’elles sont contenues dans un sac.Mélangez la poudre de feuilles avec du sable de quartz dans un récipient approprié. Celui-ci agit comme un dispersant et améliore l’efficacité du processus d’extraction. Maintenant, préparez quatre cellules d’extraction pour le remplissage en les inversant d’abord.Ensuite, insérez le filtre en fibre de verre, suivi de la fritte métallique et du bouchon de maintien. Remettez les cellules d’extraction en position verticale et ajoutez une couche de sable de quartz d’un centimètre d’épaisseur. Remplissez les cellules d’extraction avec la poudre de feuille préparée jusqu’à la ligne de remplissage.Si nécessaire, comprimez doucement la poudre pendant ce processus pour faciliter l’ajout d’une plus grande quantité dans chaque cellule d’extraction. Maintenant, ajoutez une petite couche de sable de quartz sur le dessus de la poudre tassée et insérez le filtre en cellulose supérieur. Insérez les cellules d’extraction emballées dans l’instrument d’extraction par solvant sous pression et exécutez la méthode souhaitée.Une fois la méthode terminée, concentrer la liqueur d’extraction combinée jusqu’à ce qu’elle soit sèche par évaporation rotative sous vide, comme indiqué dans le protocole textuel. Vérifiez le rendement attendu d’une boue vert foncé. Pour éliminer les chlorophylles, à l’aide d’une résine échangeuse d’ions basique, dissolvez d’abord l’extrait brut dans un volume minimal d’éthanol.Ajoutez 50 millilitres de billes de résine échangeuse d’ions basiques à la solution obtenue. Ensuite, agitez à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez 50 millilitres supplémentaires de billes de résine échangeuse d’ions basiques toutes les 30 minutes jusqu’à ce que la réaction soit terminée.Au début, les billes de résine échangeuse d’ions de base sont de couleur rose et la phase liquide est verte. Au fur et à mesure que la réaction se déroule, les billes de résine passent au vert et la phase liquide à l’orange ou à une couleur brune trouble selon l’échelle. Filtrez le mélange réactionnel à travers une courte colonne de terre de diatomées via une colonne de chromatographie flash en verre, en utilisant un soufflet manuel pour appliquer une pression.Rincez les billes de résine collectées avec de l’éthanol, puis de l’éthanol individuel à l’hexane, et enfin à l’hexane. Utilisez un volume de rinçage suffisant pour remettre les billes en suspension sur le dessus de la colonne de terre de diatomées. Enfin, combinez le filtrat, les rinçages et le concentré à sécher par évaporation rotative sous vide.Voici une image des feuilles d’une plante infiltrée avec une construction d’expression pour la protéine fluorescente GFP après cinq jours de croissance post-infiltration. Cela illustre l’étendue de la couverture d’infiltration à laquelle on peut s’attendre. Les feuilles sont disposées du haut à gauche vers le bas à droite de l’image par ordre décroissant, par rapport à leur hauteur d’origine sur la plante.Cette image représente 0,8 gramme de bêta-amyrine produite à l’aide de ce protocole, qui est pure à plus de 98 %. L’expérience a été menée à l’échelle de 459 plantes et représente un rendement isolé de 3,3 milligrammes par gramme de feuilles sèches. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de se rappeler que seules les feuilles infiltrées produiront le composé qui vous intéresse.Il est donc avantageux de récolter sélectivement ces feuilles lorsque cela est possible afin d’éviter la dilution de votre échantillon avec des tissus improductifs. Les étapes post-récolte de ce protocole sont fournies à titre d’illustration. Ils peuvent être substitués à d’autres techniques d’extraction de produits naturels et de purification selon la disponibilité de l’expertise et/ou des installations de votre établissement.Nous avons constaté que le traitement de base à base de résine échangeuse d’ions présenté dans ce protocole est une alternative pratique à la saponification plus traditionnelle suivie d’un partage liquide/liquide pour l’élimination des chlorophylles à plus grande échelle. Avant de suivre ce protocole, vous devez vous familiariser avec les données de sécurité des matériaux pour toutes les substances utilisées et prendre les précautions de sécurité appropriées. La législation locale concernant le travail avec des matières transgéniques doit être vérifiée et respectée, y compris en suivant les procédures de confinement appropriées.

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