Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

Ce protocole offre un accès pratique à l’échelle préparative aux composés triterpéniques pour une utilisation dans des études en aval, telles que la caractérisation structurelle ou l’expiration d’une activité biologique pertinente sur le plan médical. Le protocole est rapide, évolutif et permet d’utiliser des combinaisons d’enzymes simplement par la co-infiltration de différentes souches d’Agrobacterium, éliminant ainsi la nécessité de construire de grands vecteurs multigéniques. Pour commencer, inoculez une plaque de gélose LB sélective avec des stries des souches d’Agrobacterium tumefaciens souhaitées à partir de cultures mères de glycérol.

Incuber la plaque pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur sur pied. Le lendemain, inoculer individuellement 50 millilitres de milieu sélectif LB avec un échantillon de chaque souche d’Agrobacterium tumefaciens. Incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur à secouer à 200 tr/min.

Transférez individuellement les cultures de 50 millilitres dans 1 000 millilitres de milieu LB sélectif et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius dans l’incubateur à agitation à 200 tr/min. Le lendemain, granulez individuellement l’Agrobacterium tumefaciens des cultures liquides par centrifugation à 4 000 fois g. Après avoir jeté le surnageant, remettez individuellement les granulés en suspension dans 50 millilitres de tampon MMA fraîchement préparé.

Incuber les granulés remis en suspension à température ambiante dans l’obscurité pendant une heure. Maintenant, déterminez le volume approprié de chaque suspension d’Agrobacterium tumefaciens MMA pour produire une DO 600 finale d’au moins 0,2 dans un volume final total de 10 litres. Combinez les volumes déterminés de chaque suspension.

Maintenant, ajoutez un tampon MMA supplémentaire aux suspensions combinées jusqu’à un volume final d’un litre, à utiliser immédiatement pour l’infiltration du vide. Transférez le litre de suspension d’infiltration et le litre de tampon MMA 10x dans le bain d’infiltration, suivis de huit litres d’eau supplémentaires. Retirez les ailes amovibles du porte-plante sur mesure.

Insérez quatre plantes de cinq semaines qui ont été cultivées comme décrit dans le protocole de texte, et rattachez les ailes. La couverture d’infiltration est compromise si les feuilles ne sont pas complètement immergées dans la suspension d’infiltration. Ce problème est minimisé en s’assurant que le niveau de la suspension atteint la surface supérieure du support de plante avant le traitement sous vide.

Retournez le support et placez-le sur le bain d’infiltration de manière à immerger les feuilles dans la suspension d’infiltration. Transférez le bain d’infiltration avec les plantes immergées dans la chambre d’infiltration et fermez la porte. Assurez-vous que la soupape d’admission d’air est fermée sur l’infiltrateur.

Après avoir allumé la pompe à vide, ouvrez la soupape d’admission de vide sur la chambre d’infiltration. Une fois que la pression dans la chambre d’infiltration a diminué de 880 millibars, fermez la soupape d’admission à vide et ouvrez la soupape d’admission d’air. De retour à la pression atmosphérique, ouvrez la porte et retirez le bain d’infiltration.

Maintenant, soulevez le porte-plantes jusqu’à ce que les plantes ne soient plus immergées dans la suspension d’infiltration. Ensuite, secouez doucement le support pour permettre à l’excès de suspension de s’écouler des feuilles et de retourner dans le bain d’infiltration. Enfin, remettez le support en position verticale, retirez les ailes amovibles et retirez les plantes.

Cultivez les plantes infiltrées pendant cinq jours à 25 degrés Celsius en 16 heures par jour de lumière avec un arrosage quotidien. Après cinq jours de croissance, récoltez les feuilles, puis séchez-les comme décrit dans le protocole textuel. Broyez les feuilles séchées en une poudre grossière à l’aide d’une méthode pratique, comme l’utilisation d’un robot culinaire domestique ou l’écrasement manuel des feuilles lorsqu’elles sont contenues dans un sac.

Mélangez la poudre de feuilles avec du sable de quartz dans un récipient approprié. Celui-ci agit comme un dispersant et améliore l’efficacité du processus d’extraction. Maintenant, préparez quatre cellules d’extraction pour le remplissage en les inversant d’abord.

Ensuite, insérez le filtre en fibre de verre, suivi de la fritte métallique et du bouchon de maintien. Remettez les cellules d’extraction en position verticale et ajoutez une couche de sable de quartz d’un centimètre d’épaisseur. Remplissez les cellules d’extraction avec la poudre de feuille préparée jusqu’à la ligne de remplissage.

Si nécessaire, comprimez doucement la poudre pendant ce processus pour faciliter l’ajout d’une plus grande quantité dans chaque cellule d’extraction. Maintenant, ajoutez une petite couche de sable de quartz sur le dessus de la poudre tassée et insérez le filtre en cellulose supérieur. Insérez les cellules d’extraction emballées dans l’instrument d’extraction par solvant sous pression et exécutez la méthode souhaitée.

Une fois la méthode terminée, concentrer la liqueur d’extraction combinée jusqu’à ce qu’elle soit sèche par évaporation rotative sous vide, comme indiqué dans le protocole textuel. Vérifiez le rendement attendu d’une boue vert foncé. Pour éliminer les chlorophylles, à l’aide d’une résine échangeuse d’ions basique, dissolvez d’abord l’extrait brut dans un volume minimal d’éthanol.

Ajoutez 50 millilitres de billes de résine échangeuse d’ions basiques à la solution obtenue. Ensuite, agitez à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez 50 millilitres supplémentaires de billes de résine échangeuse d’ions basiques toutes les 30 minutes jusqu’à ce que la réaction soit terminée.

Au début, les billes de résine échangeuse d’ions de base sont de couleur rose et la phase liquide est verte. Au fur et à mesure que la réaction se déroule, les billes de résine passent au vert et la phase liquide à l’orange ou à une couleur brune trouble selon l’échelle. Filtrez le mélange réactionnel à travers une courte colonne de terre de diatomées via une colonne de chromatographie flash en verre, en utilisant un soufflet manuel pour appliquer une pression.

Rincez les billes de résine collectées avec de l’éthanol, puis de l’éthanol individuel à l’hexane, et enfin à l’hexane. Utilisez un volume de rinçage suffisant pour remettre les billes en suspension sur le dessus de la colonne de terre de diatomées. Enfin, combinez le filtrat, les rinçages et le concentré à sécher par évaporation rotative sous vide.

Voici une image des feuilles d’une plante infiltrée avec une construction d’expression pour la protéine fluorescente GFP après cinq jours de croissance post-infiltration. Cela illustre l’étendue de la couverture d’infiltration à laquelle on peut s’attendre. Les feuilles sont disposées du haut à gauche vers le bas à droite de l’image par ordre décroissant, par rapport à leur hauteur d’origine sur la plante.

Cette image représente 0,8 gramme de bêta-amyrine produite à l’aide de ce protocole, qui est pure à plus de 98 %. L’expérience a été menée à l’échelle de 459 plantes et représente un rendement isolé de 3,3 milligrammes par gramme de feuilles sèches. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de se rappeler que seules les feuilles infiltrées produiront le composé qui vous intéresse.

Il est donc avantageux de récolter sélectivement ces feuilles lorsque cela est possible afin d’éviter la dilution de votre échantillon avec des tissus improductifs. Les étapes post-récolte de ce protocole sont fournies à titre d’illustration. Ils peuvent être substitués à d’autres techniques d’extraction de produits naturels et de purification selon la disponibilité de l’expertise et/ou des installations de votre établissement.

Nous avons constaté que le traitement de base à base de résine échangeuse d’ions présenté dans ce protocole est une alternative pratique à la saponification plus traditionnelle suivie d’un partage liquide/liquide pour l’élimination des chlorophylles à plus grande échelle. Avant de suivre ce protocole, vous devez vous familiariser avec les données de sécurité des matériaux pour toutes les substances utilisées et prendre les précautions de sécurité appropriées. La législation locale concernant le travail avec des matières transgéniques doit être vérifiée et respectée, y compris en suivant les procédures de confinement appropriées.