Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Cette méthode fournit une technique de transfection de gènes in vivo pour manipuler l’expression des gènes dans les neurones sensoriels de souris adultes pour de futures études sur l’exo-régénération des mammifères. Le principal avantage de cette technique est qu’elle prend moins de travail et de temps, et qu’elle peut à la fois surexprimer et renverser les gènes cibles simultanément et séparément. Pour commencer cette procédure, marquez les deux côtés de la crête iliaque d’une souris anesthésiée avec un marqueur fin.

Tracer une ligne reliant deux points de la crête iliaque pour faciliter l’identification des positions des DRG L5. Ensuite, faites une incision de trois centimètres le long de la ligne médiane du bas du dos avec des micro-ciseaux. Ensuite, détachez les muscles paraépineux, tels que le muscle multifidus et le muscle longissimus lumborum, des apophyses épineuses L3 à S1, et exposez l’articulation du fascia des L4-5 et L5-6.

Ensuite, utilisez un micro rongeur pour retirer les articulations des fascias des L4-5 et L5-6. Par la suite, retirez l’arc neural gauche de L4 et L5, pour exposer la face dorsale des DRG. Pour l’injection de DRG, chargez les plasmides d’ADN ou les oligonucléotides d’ARN dans la pipette capillaire en verre.

Ensuite, insérez l’extrémité de la pipette en verre capillaire, avec précaution, dans le DRG, et injectez progressivement une solution d’un microlitre de plasmides d’ADN ou d’oligos d’ARN à l’aide du système de distribution de micro-injection intracellulaire. Pour l’électroporation, pincez doucement le DRG cible avec les électrodes et appliquez cinq impulsions électriques carrées avec le système d’électroporation. Par la suite, fermez le muscle, puis les couches de peau avec des sutures en nylon.

Deux ou trois jours après l’électroporation DRG, anesthésez la souris par voie intrapéritonéale, collez ses membres sur le panneau de liège et faites une incision d’un centimètre à 0,5 centimètre sur le côté gauche le long de la ligne médiane. Ensuite, coupez les muscles, tels que le muscle fessier et le muscle piriforme, longitudinalement. Ensuite, exposez le segment du nerf sciatique entre le grand foramen sciatique et l’encoche sciatique.

Écrasez le nerf avec une pince de microchirurgie pendant 12 secondes et marquez le site d’écrasement avec une suture épineurale en nylon. Ensuite, fermez les couches musculaires et cutanées avec une suture en nylon. Après la profusion, séparez les DRG avec les racines nerveuses et le nerf sciatique, soigneusement, avec des micro-ciseaux et des micro-pinces sous le microscope de dissection.

Ensuite, transférez le nerf sciatique directement dans 4 % PFA pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pour imager et mesurer les axones sensoriels marqués par fluorescence au microscope de dissection, retirez soigneusement le tissu et la membrane attachés au nerf sciatique fixe à l’aide de micro-ciseaux et de micro-pinces. Ensuite, lavez le nerf avec PVS trois fois.

Ensuite, placez le nerf sciatique sur une lame et maintenez-le droit. Ajoutez 80 microlitres de solution anti-décoloration autour du nerf, puis posez une lamelle de couverture dessus. Aplatissez tout le tissu monté avec une pression.

Ensuite, placez le tissu aplati sous le microscope à épifluorescence inversée, équipé d’un accessoire pour l’acquisition de mosaïque et le traitement d’image. Lorsque vous mesurez la longueur des axones régénérés, tracez tous les axones identifiables marqués par fluorescence dans le nerf sciatique, du site d’écrasement aux extrémités distales des axones. Lors de l’application de la méthode actuelle d’électroporation in vivo pour étudier la régénération axonale, le nerf sciatique a été aplati et imagé.

Chaque axone régénéré avec une trajectoire distinctive et une extrémité axonale distale reconnaissable peut être tracé à partir du site d’écrasement indiqué par le nœud de suture. La pointe de flèche blanche, la flèche et l’étoile indiquent trois extrémités axonales distinctes, qui s’étendent toutes à partir du site d’écrasement. De plus, les DRG ont été électroporés avec des plasmides EGFP, et la moelle épinière a été prélevée.

Les axones de la colonne dorsale marqués à l’EGFP, dans la moelle épinière, ont été imagés et identifiés dans les images longitudinales et sagittales en projection. Voici une vue détaillée des axones dans la colonne dorsale, et voici une vue détaillée des axones dans la zone d’entrée de la racine dorsale. Cette image montre la projection sagittale des axones marqués EGFP dans la colonne dorsale.

Alternativement, les images confocales peuvent être traitées avec un logiciel de visualisation par microscopie pour reconstruire une image 3D. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de positionner correctement les DRG L4 et L5, et de faire un nœud sur la membrane durale sans empaler le nerf sciatique, tout en marquant le site d’écrasement avec un nœud de suture. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération axonale pour explorer les gènes nécessaires au SNP, à la régénération axonale naturelle ou aux gènes qui peuvent favoriser davantage la régénération chez la souris adulte in vivo.