L’acide hyaluronique basée Hydrogels pour 3-Dimensional Culture de cellules de glioblastome dérivé de Patient

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les tumeurs du glioblastome et sur la façon dont la matrice extracellulaire peut faciliter la résistance au traitement. Cette technique permet la construction modulaire de plateformes de culture cellulaire 3D adaptables qui peuvent être utilisées pour cultiver des cellules de glioblastome dérivées de patients dans un environnement qui se rapproche mieux du cerveau natif. Pour commencer, placez des moules en caoutchouc de silicone propres et secs dans chaque puits d’une plaque de 12 puits non traitée pour la culture tissulaire et utilisez l’extrémité émoussée propre d’une pointe de pipette pour faire adhérer les moules au fond de la plaque.

Après avoir vérifié l’étanchéité entre les moules et les fonds de puits, prélevez les gliomasphères dissociées d’une culture cellulaire de glioblastome par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un millilitre d’enzyme de dissociation cellulaire. Après cinq minutes à température ambiante, agitez le tube en tapotant doucement et arrêtez la réaction enzymatique avec quatre millilitres de milieu complet. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet frais avant de filtrer les cellules à travers un filtre de 70 micromètres.

Lavez la passoire avec quatre millilitres supplémentaires de fluide complet et divisez la suspension en deux aliquotes de huit fois 10 à la quatrième cellule par tube de centrifugation. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre en suspension une pastille dans 80 microlitres de polyéthylène glycol maléimide ou PEG-Mal-RGD fraîchement préparé et une pastille dans 80 microlitres de solution PEG-Mal-CYS fraîchement préparée par moule. À l’aide d’une pointe de micropipette à orifice de 200 microlitres de large, ajoutez 40 microlitres de solution d’acide hyaluronique dans chaque moule en caoutchouc et de silicone, suivis de 40 microlitres de la solution cellulaire PEG-Mal-CYS ou PEG-Mal-RGD.

Pipetage rapide de haut en bas pas plus de 10 fois par moule pour mélanger. En raison du temps de gélification rapide, une fois que les deux composants de l’hydrogel sont mélangés, il est important d’utiliser une pointe de pipette à large orifice pour mélanger les solutions rapidement mais complètement. Cette étape demande de la pratique.

Ensuite, placez les cellules encapsulées dans du gel dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant cinq à 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez deux à deux millilitres et demi de milieu de culture à chaque gel et utilisez une pointe de pipette stérile de deux microlitres et une pince pour séparer délicatement les gels des côtés des moules. Ensuite, à l’aide d’une pince stérilisée, retirez les moules des puits de la plaque et remettez la plaque dans l’incubateur cellulaire.

Pour l’extraction sur cellule unique, au point final expérimental approprié, retirer le surnageant des puits et transférer la culture en gel de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre. Incuber les gels avec 500 microlitres d’enzyme de dissociation cellulaire pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius avec des effleurements occasionnels et transférer les mélanges dans des tubes à centrifuger individuels de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieu complet par tube sur de la glace. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 20 pour aspirer doucement chaque suspension cellulaire à travers la pointe de l’aiguille huit fois et filtrer les mélanges à travers une crépine de cellules de 70 micromètres dans de nouveaux tubes à centrifuger de 50 millilitres.

Lorsque vous dissociez les cellules de l’hydrogel, assurez-vous d’appuyer lentement sur le piston de la seringue pour éviter les voiles qui peuvent compromettre l’intégrité de la membrane cellulaire. Lavez les passoires avec cinq millilitres de milieu frais et récupérez les cellules par centrifugation. Ensuite, mettez les pastilles en suspension dans le tampon de cytométrie en flux approprié pour la coloration et le tri selon les protocoles standard.

Pour cryoconserver les hydrogels pour la section, retirez le surnageant des puits de la plaque et incubez les cultures de gel avec deux millilitres de paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez le fixateur par deux millilitres de saccharose à 5 % dans du PBS pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, remplacer le saccharose à 5 % par deux millilitres de saccharose à 20 % dans du PBS pour deux incubations de 30 minutes à température ambiante.

Après la deuxième incubation de 30 minutes, rafraîchissez une fois de plus le saccharose à 20 % pour une incubation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, remplacez délicatement le saccharose dans la solution PBS par 20 % de saccharose à température de coupe optimale ou dans un milieu OCT en prenant soin de couvrir entièrement chaque gel et de placer la plaque à quatre degrés Celsius pendant trois heures supplémentaires. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une grande spatule plate, transférez soigneusement chaque gel au centre d’un moule d’enrobage et remplissez les moules d’enrobage avec de l’OCT pur jusqu’en dessous des bords supérieurs des moules.

Ensuite, congelez les échantillons d’hydrogel dans du 2-méthylbutane refroidi et sectionnez les échantillons d’hydrogel sur un cryostat selon les protocoles standard. L’installation d’hydrogels de 80 microlitres à quatre fois 10 à quatre cellules par densité de gel entraîne constamment des taux de prolifération comparables ou supérieurs à ceux des cultures de gliomasphère. Par exemple, quatre jours après l’encapsulation, les cellules de glioblastome dans des hydrogels contenant des RGD présentent un phénotype invasif tandis que les cellules cultivées dans un hydrogel à l’aide de PEG-Mal-CYS présentent une morphologie sphérique.

Ces cultures robustes permettent d’évaluer les effets de réactifs comme le cyclo RGD soluble qui perturbent de manière compétitive les interactions des cellules avec le RGD incorporé dans les hydrogels. À l’aide de l’imagerie par bioluminescence, un nombre relatif de cellules viables peut être observé dans des cultures d’hydrogel, par exemple, au cours d’un traitement de 12 jours à l’erlotinib. L’analyse par transfert Western de la poly ADP polymérase clivée indique que le degré relatif d’apoptose dans les cellules CD44 inactivées traitées est plus élevé que celui observé dans les cellules de glioblastome de type sauvage cultivées dans des hydrogels d’acide hyaluronique à 0,5 %.

De plus, les cryosections de cultures 3D à base d’hydrogel préservent la matrice extracellulaire déposée par les cellules cultivées. Par exemple, permettre l’analyse des modèles de dépôt des changements de collagène de type quatre lors d’un traitement à l’erlotinib. Lors de cette procédure, il est important d’évaluer le degré de thiolation de chaque lot d’acide hyaluronique.

Il est également important de trouver de nouvelles solutions de précurseurs pour chaque fois que vous faites une expérience d’encapsulation cellulaire. Le développement de cette technique a permis aux chercheurs en cancérologie d’évaluer l’efficacité de traitements nouveaux et existants et d’explorer les mécanismes de résistance au traitement et de progression du cancer du cerveau, le tout à l’aide d’un modèle ex vivo.