« Foie-on-a-Chip » Cultures d’hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer pour Infection de Virus de l’hépatite B

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans les infections hépatotropiques et les maladies du foie. Comme la contribution des populations cellulaires résidentes du foie à la pathogénie virale, à la cinétique longitudinale des infections, aux mécanismes de réplication virale, à l’invasion immunitaire, dans un système modèle physiologique et aux études de dépistage des drogues. Le principal avantage de cette technique est la capacité de récapituler un microenvironnement hépatique.

Qui peut être maintenu pendant de longues périodes de temps et est naturellement sensible à l’infection à l’hépatite B à des niveaux physiologiquement pertinents. Cela a déjà été une contrainte fondamentale dans le domaine de l’hépatite B. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie ou le diagnostic de l’infection par le VHB parce que des études de dépistage de drogues peuvent être effectuées dans une plate-forme physiologique pendant de longues durées.

Cela permet l’évaluation des traitements médicamenteux séquentiels ainsi que l’analyse de l’efficacité des stratégies de traitement existantes et nouvelles. Cette méthode peut fournir la compréhension dans l’hépatite B, et peut également être appliquée à d’autres études de la maladie, y compris d’autres infections hépatotropiques, les maladies du foie, ou des études de métabolisme de drogue. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, car il faut une attention particulière à des détails particuliers pour permettre le maintien réussi des tissus hépatiques pendant de longues périodes de temps.

Et aussi la familiarisation avec les outils et l’équipement spécialisés. La démonstration visuelle de cette méthode est critique. Y compris l’assemblage des plaques, ainsi que le dégel et l’ensemencement des cellules.

Étant donné que les étapes impliquées dans la culture à long terme des cellules dérivées du foie sont difficiles lors de l’utilisation d’un nouveau système de culture. Tout d’abord, allumez à la fois le compresseur et la pompe à vide associées à la plate-forme de copeaux de foie. Procéder à une armoire à tubes en verre pour assembler et équilibrer les plaques.

Placez une membrane stérile sur la base de la plaque pour commencer à assembler aseptiquement les plaques microfluidiques. S’assurer que la membrane stérile repose en douceur sur les deux broches de la plaque de base. Ajouter ensuite la plaque supérieure bien contenant.

Ajouter un couvercle de plaque stérile. Et utilisez un couple de précision automatisé, réglé à 33 livres. À l’aide d’une séquence de serrage en spirale pour serrer les vis à la base de la plaque.

À l’aide d’un couple manuel, assurez-vous que toutes les vis sont serrées à 35 livres. Ensuite, préchauffer l’ensemencement des hépatocytes à 37 degrés Celsius avant l’amorçage. Placez la plaque entièrement assemblée dans le quai de lavage.

Et assurez-vous que la plaque s’enclenche complètement. Ajouter 400 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes au côté réservoir de chaque puits pour amorcer la plaque. Après cela, lancer le flux dans la direction ascendante pendant 3,5 minutes à un microlitre par seconde.

Les indicateurs rouges sur le côté de la plaque indiqueront si la circulation microfluidique fonctionne correctement. Une fois que le milieu est pompé sur le côté croissance cellulaire de la plaque, ajouter 1,2 millilitres supplémentaires de milieu d’ensemencement des hépatocytes. Transférez soigneusement la plaque dans la station d’amarrage à l’intérieur d’un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Lancez le débit vers le haut à un débit d’un microlitre par seconde pendant 16 heures. Après cela, transférer la plaque sur un quai de lavage. Pipette doucement de haut en bas pour éliminer les bulles.

À l’aide d’un forceps stérile, ajouter un papier filtre rond stérile à chaque puits. Ajoutez ensuite un échafaudage de fixation cellulaire et un anneau de soutoutage à chaque puits. Utilisez un piston stérile pour pousser chaque puits et verrouiller les anneaux de soutine et les échafaudages en place.

Ensuite, aspirez tout le milieu. Et ajouter délicatement 400 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes préchauffé sur l’échafaudage. Lancer le débit dans une direction descendante à un microlitre par seconde pendant 3 1/2 minutes.

Aspirer tous les moyens pompés du côté réservoir de la plaque. Ajouter 1,4 millilitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes à chaque puits. Retournez ensuite la plaque au quai pour porter le volume total par puits jusqu’à 1,6 millilitre.

Tout d’abord, préchauffer le milieu de décongélation des hépatocytes et l’ensemencement des hépatocytes moyen à 37 degrés Celsius. Ensuite, décongelez un flacon d’hépatocytes humains primaires selon les instructions du fournisseur. Dans une armoire à tube de verre, resuspendre les cellules en un millilitre de milieu d’ensemencement d’hépatocytes.

Ensuite, placez les cellules résuspendées sur la glace. À l’aide du bleu trypan, comptez les cellules pour vous assurer que la viabilité des cellules est supérieure à 90 % Transférez la plaque entièrement assemblée au quai de lavage. Et aspirer tous les médiums des puits.

Récupérez les cellules de la glace, et ajoutez 600 000 hépatocytes à chaque puits dans un volume de 500 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes. Lancez le débit dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde. Ajouter 900 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes à chaque puits pour porter le volume total de chacun à 1,6 millilitres.

Transférer la plaque à la station d’amarrage dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et avec 5 % de CO2. Lancer le débit dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant huit heures. Après cela, inverser le flux vers la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant huit heures.

Ensuite, transférez la plaque à la cale de lavage, et aspirez tous les moyens des puits. Ajouter 400 microlitres de milieu d’entretien des hépatocytes à chaque puits. Et lancer le flux dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 3 1/2 minutes.

Ensuite, aspirez tous les moyens du réservoir et ajoutez 1,4 millilitres de milieu d’entretien des hépatocytes. Transférer la plaque dans la station d’amarrage dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Lancez le débit dans la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 48 heures.

Après 48 heures, laver la plaque en la transférant au quai de lavage. Aspirer tous les médiums des puits. Et ajouter 400 microlitres de support d’entretien.

Et lancer le flux dans la direction descendante à un microlitre par seconde pendant 3,5 minutes. Ensuite, aspirez tous les médiums apparaissant dans le côté réservoir des puits. Ajouter 1,4 millilitres de milieu d’entretien des hépatocytes.

Ensuite, transférez la plaque à la station d’amarrage dans l’incubateur humidifié. Lancez le débit dans la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 48 heures. Remplacez le milieu à l’aide de ce procédé de lavage et de remplacement toutes les 48 heures.

Les hépatocytes humains primaires ne sont généralement stables que pendant une période limitée lorsqu’ils utilisent des systèmes de culture conventionnels. Toutefois, en utilisant le protocole décrit ici, ils peuvent être maintenus fonctionnellement pendant de longues périodes de temps. L’albumine humaine est sécrété par des hépatocytes fonctionnels, et est considéré comme le meilleur marqueur pour évaluer la fonctionnalité hépatique.

Albumin est considéré comme stably et fortement exprimé par les cultures 3D jusqu’au jour au moins 40 post-ensemencement. Pour les co-cultures, la fonctionnalité et la viabilité des cellules Kupffer sont évaluées en mesurant la sécrétion de cytokines spécifiques. Comme on le voit ici, les niveaux mesurés d’IL-6 et de TNF alpha indiquent que les cellules ont été fonctionnellement maintenues et viables.

En plus de conserver leur métabolisme cellulaire physiologique, ces cultures sont devenues exceptionnellement sensibles à l’infection par le VHB. L’ADN du VHB et d’autres marqueurs viraux sont facilement détectables dès le deuxième jour après l’infection. Alors que les cultures conventionnelles nécessitent une inoculation avec au moins 500 équivalents génomiques du VHB complétés par le DMSO et le PEG, ces cultures 3D sont infectées par aussi peu que 05 équivalents génomiques non complémentaires.

En plus des marqueurs sécrétés de l’infection virale, des échafaudages contenant des hépatocytes sont récupérés de ces cultures. La microscopie immunofluorescence révèle que ces échafaudages contiennent des antigènes viraux. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être doux lors de la manipulation des hépatocytes avant l’ensemencement pour éviter la mort cellulaire.

En outre, il est essentiel de s’assurer que les plaques sont correctement assemblées et que tous les canaux d’écoulement permettent une circulation correcte des médias avant l’ensemencement des hépatocytes. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions. Y compris l’emplacement et la fréquence des cellules infectées dans le tissu.

L’état physiologique des hépatocytes peut également être évalué en souinant pour l’albumine ou les structures hépatiques, y compris la protéine de jonction serrée ZO-1. Après ce développement, cette technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de la virologie pour explorer l’infection à l’hépatite B et les réponses immunitaires dans un système modèle 3D physiologique. N’oubliez pas que le travail avec le virus de l’hépatite B peut être dangereux, et des précautions telles que la vaccination précédente, l’utilisation d’EPI appropriées et le travail selon les lignes directrices appropriées en matière de biosécurité devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.