Isolation de F1-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei

La purification de la F1-ATPase est basée sur une méthode biochimique classique qui s’est avérée cruciale pour notre compréhension du mécanisme de production d’ATP par d’autres synthases ATP. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit une enzyme très pure adaptée à la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou microscopie cryo-électronique. Bien que ce protocole soit optimisé pour l’isolement de F1-ATPase des trypanosomes, il peut être adapté à d’autres sources, telles que les tissus ou les cellules de culture, et à divers protistes pathogènes.

Cette technique peut conduire à l’identification de nouveaux médicaments pour traiter les maladies humaines graves. Par exemple, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase est une cible de médicaments authentifiée pour le traitement de la tuberculose. Pour commencer le protocole, décongeler et résuspendre doucement les vésicules mitochondriales, également connues sous le nom de mitoplastes, précédemment isolées par lyse hypotonique d’une fois 10 à 11 à deux fois 10 à 11 cellules de trypanosoma brucei procyclique dans cinq millilitres de tampon glacé A.Gardez l’échantillon refroidi.

Ensuite, déterminez la concentration de protéines dans la suspension par l’acide bicinchoninique, ou BCA, analyse des protéines selon les instructions du fabricant. Effectuez une série de dilution BSA dans de l’eau ultra pure pour construire la courbe standard. Diluer une petite quantité de l’échantillon 20 à 100 fois avec de l’eau ultra pure pour s’adapter à la gamme des normes BSA.

Après avoir calculé la quantité totale de protéines dans l’échantillon, porter la concentration protéique à 16 milligrammes par millilitre en la diluant avec un tampon supplémentaire A.Puis fragmenter les mitoplastes en vésicules inversées et des morceaux de membrane par sonication sept fois pendant 15 secondes chacun, avec une énergie totale de 70 à 100 joules par impulsion avec un microtipe avec un diamètre de 3,9 millimètres. Pendant la fragmentation, incuber l’échantillon sur la glace pendant 30 secondes entre les impulsions. Après la sonication, la suspension peut sembler légèrement plus foncée.

Sédimenter les fragments de membrane par ultracentrifugation à 54 000 g pendant 16 heures ou à 98 000 g pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Décanter le supernatant et procéder à l’extraction du chloroforme. Calculez le volume du tampon B en fonction de la quantité totale de tampon A utilisée.

Transférer les sédiments gelés du tube de centrifugeuse dans l’homogénéiseur. Resuspendez la pastille des membranes mitochondriques dans le tampon B à l’aide d’un petit homogénéiseur Dounce. Transférer la suspension dans un tube conique de 50 millilitres.

Retirez l’échantillon de la glace et conservez l’échantillon et toutes les solutions à température ambiante pour les étapes restantes. Ajouter ensuite le chloroforme saturé de deux tris molaire ajustés avec hcl au pH 8,5, un à un. Fermez le bouchon hermétiquement et secouez vigoureusement l’échantillon pendant exactement 20 secondes.

Centrifuger immédiatement le mélange à 8 400 g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, transférez la phase aqueuse supérieure et nuageuse à des microtubes de 1,6 millilitre. Ajouter des inhibiteurs de la protéase à l’échantillon pour remplacer les inhibiteurs éliminés par le traitement au chloroforme.

Centrifuger les échantillons à 13 000 g pendant 30 minutes à température ambiante. Après la rotation, transférer le supernatant sur des microtubes frais et répéter la centrifugation pour enlever tout matériau insoluble restant. Equilibrer la colonne Q d’échange d’anion de cinq millilitres attachée à un système de chromatographie liquide protéique rapide avec 50 millilitres de tampon de colonne Q à un débit de cinq millilitres par minute jusqu’à ce que l’absorption à 280 nanomètres et la conductivité se stabilisent.

Chargez le supernatant sur la colonne équilibrée à un débit d’un millilitre par minute. Attendez que l’absorption à 280 nanomètres se stabilise à l’arrière-plan. Appliquez un gradient linéaire de 25 millilitres du tampon d’élitution de la colonne Q de 0 % à 100 % à un débit de 0,5 millilitres par minute et recueillez une fraction millilitre.

Analyse de 10 microlitres de chaque fraction individuelle correspondant au pic d’élitution majeur pour l’activité hydrolytique ATP par millilitre de mélange de réaction par l’essai Pullman ATPase au pH 8.0. Mettre en commun les fractions qui présentent l’activité ATPase. Concentrez l’échantillon mis en commun par ultrafiltration membranaire à l’aide d’une colonne de spin avec un filtre PES de coupure de poids moléculaire de 100 000 à 200 à 500 microlitres.

Ensuite, passez à la chromatographie d’exclusion de taille. Equilibrer la colonne Superose 6 Increase attachée à un système de chromatographie liquide avec au moins 48 millilitres de tampon SEC à un débit de 0,5 millilitres par minute. Appliquez l’échantillon sur la colonne.

Exécutez la chromatographie à un débit de 0,25 millilitres par minute, tout en collectant des fractions de 0,25 millilitre. Ensuite, exécutez 10 microlitres des fractions qui correspondent aux pics de la trace d’absorption uv 280 nanomètres sur SDS-PAGE. Puis tacher les échantillons avec Coomassie Blue.

Analysez les fractions correspondant au premier pic majeur contenant le pic de F1 pour l’activité hydrolytique ATP et la sensibilité à l’azide par l’essai Pullman ATPase. Effectuez ensuite un test BCA pour déterminer la concentration en protéines. Enfin, gardez le F1-ATPase purifié à température ambiante et utilisez-le dans les trois jours suivant la purification pour les applications en aval.

Ce profil d’élitution d’une chromatographie d’échange d’anion affiche l’absorption UV à 280 nanomètres et la concentration de chlorure de sodium dans le tampon d’élitution. Les fractions sélectionnées ont été séparées sur le gel SDS-PAGE et tachées de colorant Coomassie Blue. Les fractions qui correspondent au pic majeur d’élitution de la chromatographie d’échange d’anion et contiennent le F1-ATPase ont été mis en commun, concentrés et utilisés comme entrée pour la chromatographie d’exclusion de taille.

Le principal contaminant est la déshydrogénase dihydrolipoyle, qui s’échappe de la colonne chromatographie d’exclusion de taille comme un pic discret. La F1-ATPase s’élit dans le premier sommet dominant, largement symétrique. La coloration Bleue Coomassie d’un motif de bande typique après la séparation de la F1-ATPase purifiée via SDS-PAGE montre des bandes faibles sporadiques visibles au-dessus du sous-unité bêta, qui représentent des sous-complexes de l’alpha trois bêta trois casques, dimers et oligomers des sous-unités alpha et bêta, et sont dépourvus de tout contaminant détectable par spectrométrie de masse.

Tout en effectuant l’extraction du chloroforme, l’étape critique du protocole, il est essentiel de secouer vigoureusement l’échantillon et de procéder immédiatement à la séparation centrifuge des phases organique et aqueuse. Suite à cette procédure, le F1-ATPase isolé peut être caractérisé en détail par spectrométrie de masse. En outre, il peut être utilisé dans les analyses d’activité ou pour les études structurelles, soit sur son propre ou en présence de divers inhibiteurs ou analogues substrat.