In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Nous présentons une en vivo biphotonique imagerie protocole d’imagerie du cortex cérébral de souris néonatales. Cette méthode convient pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique neuronale et les changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurosciences, en particulier celles liées à la formation de prises de neurones. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent analyser les changements morphologiques des neurones individuels chez les souris néonatales vivantes. Commencez par un chiot anesthésié après le cinquième jour natal et procédez seulement en l’absence d’une réaction au test de pincement de la queue.

Tout d’abord, stériliser le cuir chevelu en l’essuyant avec 70% d’éthanol. Ensuite, utilisez des ciseaux stérilisés avec 70% d’éthanol pour enlever environ 20 millimètres carrés de la peau couvrant le crâne. Ensuite, utilisez des forceps stériles et un coton-tige propre trempé dans le tampon cortex, pour enlever le fascia du crâne.

Utilisez une pointe de chargement pour appliquer l’adhésif tissulaire sur la surface incisée de la peau pour arrêter le saignement tout en évitant la zone à image. Placez le chiot sur un autre coussin chauffant, fixé à 37 degrés Celsius, et laissez-le récupérer de l’anesthésie. Attendez environ 30 minutes jusqu’à ce que l’adhésif tissulaire ait séché et solidifié.

Une fois que l’adhésif tissulaire a séché, commencer la préparation de la fenêtre crânienne sur la souris ré-anesthésiée. Appliquez une goutte de tampon de cortex sur le crâne, puis utilisez une lame stérile de rasoir pour ouvrir soigneusement une zone d’un millimètre de diamètre du crâne, laissant la dura intacte. Appliquer le tampon du cortex pour garder la surface du cerveau humide.

Utilisez un petit morceau d’éponge gélatineux trempé dans le tampon du cortex pour arrêter tout saignement. Utilisez un morceau frais pour compresser un côté de la craniotomie et drainer tout tampon et le sang de la surface durale sans toucher le dura. Il s’agit de l’étape la plus critique pour préparer une fenêtre claire.

Le dura doit être intact et la brosse doit être retirée du dura exposé. Ensuite, utilisez une pointe de pipette pour appliquer une fine couche d’agarose fondante d’un pour cent faible, dissoute dans le tampon du cortex. Appliquer un couvercle en verre rond de trois millimètres sur la couche de gel agarose.

Enlevez toutes les bulles entre le glissement de couverture et la couche de gel d’agarose en versant au-delà du gel d’agarose entre eux. Utilisez des pinces à épiler pour enlever l’excès de gel, en saillie sous le bordereau de couverture. Mélanger la poudre de ciment et le liquide cimenté.

Utilisez une pointe de pipette pour appliquer le mélange sur le crâne avant qu’il ne se solidifie. Ensuite, fixez une barre de titane sur mesure à l’os crânien à l’aide de ciment dentaire. Alignez la barre de titane, et le glissement de couverture en parallèle pour capturer facilement des images.

Couvrir le crâne exposé de ciment dentaire. Ensuite, injectez subcutanément un analgésique. Placez le chiot dans une cage de récupération sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius pendant une heure jusqu’à ce que le ciment dentaire se soit solidifié.

Pour commencer l’imagerie, réglez d’abord la longueur d’onde laser à deux photons. Pour l’excitation de la DP, utilisez une longueur d’onde de 1000 nanomètres. Essuyer la surface du bordereau de couverture avec 70% d’éthanol.

Fixez le chiot anesthésié à la plaque de titane au stade d’imagerie, à l’aide de la barre de titane. Utilisez le stade goniomètre, pour ajuster la tête, de sorte que le glissement de couverture est parallèle à la lentille objective. Maintenir la température corporelle du chiot pendant l’imagerie à l’aide d’un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius et réduire la concentration d’isoflurane à 0,7 % à 1 %Placez l’étape d’imagerie sous la lentille objective 20x des deux microscopes photons.

Appliquer une goutte d’eau sur le bordereau de couverture. Réglez le logiciel pour acquérir des images Z-stack à intervalles de 1,4 micron. Pour l’imagerie neuronale de la couche quatre, réglez la largeur Z entre 150 et 300 microns pour l’image de toute la morphologie dendritique.

Utilisez la numérisation lente et la moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale. Il faut généralement plus de 20 minutes pour acquérir toute la morphologie dendritique. Cette image montre une image représentative Z-stack de la couche quatre neurones corticals de chiot P5.

La flèche indique le neurone à analyser. Les neurones avec des dendrites flous doivent être retirés de l’analyse. Cette image montre une image de grossissement plus élevée du neurone indiqué dans l’image précédente.

Les pointes de flèche bleues indiquent des pointes dendritiques qui seront rétractées au point suivant, et les petites pointes de flèche blanches indiquent l’axon d’une cellule voisine. Après 4,5 heures, les pointes dendritiques avec des pointes de flèche bleues sont rétractées, et les pointes dendritiques avec des pointes de flèche jaunes sont allongées. Une reconstruction de morphologie dendritique représentative est montrée ici, les neurones montrant des dendrites déconnectés comme on le voit ici, devraient être exclus des analyses.

Tout en essayant cette procédure, il est important de garder le dura intact, pendant le processus. En utilisant cette procédure, d’autres méthodes comme dans l’imagerie de propulsion peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires liées au modèle d’activité neuronale dans le cerveau néonatal.