Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Le séquençage à ARN à cellules simples est un outil puissant pour étudier les profils transcriptionnels des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes, tels que le système nerveux central. Ce protocole fournit une méthode pour isoler les noyaux pour le séquençage de l’ARN à noyau unique. En utilisant des noyaux au lieu des cellules, cette méthode peut être appliquée aux tissus difficiles à dissocier, ainsi qu’aux tissus congelés.

En outre, cette méthode peut être appliquée pour étudier les changements spécifiques au type de cellule dans les cellules à la suite d’une maladie ou d’une blessure. Commencez cette procédure par l’euthanasie de souris, telle que décrite dans le protocole de texte. Ensuite, faire une incision le long de la longueur du corps pour exposer les organes intérieurs.

Éviscérer la souris en tirant les organes intérieurs de la cavité du corps à l’aide de forceps. N’utilisez pas de serviettes en papier pour nettoyer la zone ou pour enlever les organes, car cela peut introduire des contaminants. À l’aide de ciseaux, couper la colonne vertébrale entre les vertèbres vertébrales L2 et L3.

Pour éjecter la moelle épinière, placez une seringue de trois millilitres contenant du PBS glacé à l’aide d’une aiguille de calibre 1/4 pouce de calibre 25. Placez la pointe de l’aiguille dans l’extrémité sacrée de la colonne vertébrale. Utilisez deux doigts pour pincer les vertèbres pour créer un joint serré autour de la pointe de l’aiguille, et appuyez sur le piston pour éjecter la moelle épinière rostrally.

Placer la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec du PBS glacé. Si seulement la partie lombaire du cordon est nécessaire, coupez les parties sacrées et thoraciques de la moelle épinière. À ce stade, congeler le tissu et stocker à moins 80 degrés Celsius, ou utiliser immédiatement pour soit la lyse cellulaire mécanique détergent comme décrit ici, ou hypotonique lyse mécanique comme décrit dans le protocole de texte.

Pour déterminer la lyse cellulaire mécanique détergente, placez la moelle épinière lombaire dans un homogénéiseur Dounce pré-refroidi et ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse de détergent pré-refroidi. Dounce avec cinq coups du pilon lâche, A, puis cinq à 10 coups du pilon serré, B.Évitez de soulever l’homogénéisateur en dehors de la solution de lyse entre les coups, et évitez d’introduire des bulles. Maintenant, placez une passoire de 40 microns sur un tube conique pré-refroidi de 50 millilitres et pré-humide avec un millilitre de tampon de saccharose faible.

Ajouter un millilitre de tampon à faible saccharose à l’homogénéiseur Dounce contenant les noyaux bruts dans le tampon de lyse, et mélanger délicatement en pipetting deux à trois fois. Passez la préparation des noyaux bruts au-dessus de la passoire de 40 microns dans le tube conique pré-refroidi de 50 millilitres. Passez un tampon supplémentaire d’un millilitre de saccharose bas au-dessus de la passoire de 40 microns, ce qui porte le volume final à trois millilitres du tampon à faible saccharose et à 500 microlitres du tampon de lyse.

Répétez ces étapes si vous combinez plusieurs cordons, en refroidissant dans le même tube conique. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 3200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, décanter le surnatant.

Nous suspendons la palette à l’aide de trois millilitres de tampon saccharose faible. Tourbillonnez doucement pour enlever la pastille du mur pour faciliter la resuspension. Après avoir laissé reposer l’échantillon sur la glace pendant deux minutes, transférez la suspension dans un tube Oak Ridge.

À l’aide de l’homogénéisant au réglage d’un, homogénéiser les noyaux dans un tampon à faible saccharose pendant 15 à 30 secondes, en gardant l’échantillon sur la glace. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour superposer 12,5 millilitres de tampon saccharose de densité, sous l’homogénéité tampon à faible saccharose, en prenant soin de ne pas créer une bulle qui perturbe les couches de densité. Centrifuger les tubes à 3200 fois G, pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Une fois la centrifugation terminée, décantez immédiatement le supernatant dans un mouvement de scintillement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’enlever immédiatement le tube Oak Ridge de la centrifugeuse, et de décanter rapidement le supernatant. En utilisant 100 microlitres à un millilitre de solution de resuspension, nous suspendons les noyaux restant sur le mur.

Évitez le froncement de sourcils myélin qui reste avec la préparation à base de détergent. Si vous ne faites pas ces étapes rapidement, vous pouvez entraîner une préparation des noyaux avec un excès de débris cellulaires, ou de la myéline, ce qui peut entraver le séquençage de l’ARN à noyau unique en aval. Filtrer les noyaux à travers une passoire de taille pore de 30 à 35 microns et les recueillir dans un tube pré-refroidi.

Déterminer le rendement des noyaux, à l’aide d’un hémocytomètre pour compter les noyaux dans un objectif de 10 x, avant de procéder au séquençage de l’ARN à noyau unique, tel que décrit dans le protocole de texte. Des images brillantes de champs et d’épifluorescentes de noyaux, isolées à l’aide du protocole de lyse mécanique détergent, sont montrées à 10 x. Ces noyaux sont isolés d’une manière impartiale, permettant l’étude des profils d’expression des gènes endogènes au niveau d’une seule cellule.

Montré ici, est une parcelle représentative tSNE de séquençage de l’ARN à noyau unique, à partir d’une moelle épinière lombaire de souris, en utilisant une plate-forme d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle. Les noyaux isolés des tissus frais ou congelés peuvent être utilisés pour le séquençage sur des plateformes commerciales et académiques. Cette technique permet aux chercheurs d’explorer les profils transcriptionnels au niveau d’une seule cellule, en utilisant des tissus difficiles à dissocier, comme la moelle épinière, ou même des tissus congelés, comme le matériel biobanque.

Tout en essayant cette procédure, il est important de réduire le temps entre l’euthanasie et la lyse cellulaire. En outre, il est important de minimiser les bulles introduites dans les solutions de la lyse cellulaire à la résuspension, et d’acheter des noyaux pour animaux de compagnie avec soin. Suite à cette procédure, les noyaux peuvent être utilisés pour d’autres applications, telles que le tri des facs, afin d’isoler des types de cellules spécifiques.