Name: En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique in vivo des cellules ciliées chez Danio rerio larvaire. Cette méthode permet de visualiser la mécanotransduction et l'activité présynaptique pour étudier l'audition et l'équilibre.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche intra-muros NIH/NIDCD 1ZIADC000085-01 (KSK). Nous tenons à remercier Candy Wong son aide à la rédaction de la macro de Fidji. Nous tenons également à remercier Doris Wu et Candy Wong pour leurs suggestions utiles avec le protocole.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’imagerie in vivo chez les animaux intacts est intrinsèquement difficile. Plusieurs étapes de cette méthode sont essentiels à l’obtention de mesures calcium fiable en vivo de cellules ciliées ligne latérale. Par exemple, il est très important que la larve est épinglée et paralysée correctement avant d’imagerie pour minimiser le mouvement pendant la formation image. Mouvement excessif pendant la formation image peut conduire à des changements en fluorescence GCaMP6s qui ne sont pas des vrais signaux et ne correspondent pas à des changements dans les niveaux de calcium (par exemple, Figures 4 b 1 '-B1'' et 4 C 1'-C1''). Broches de la queue peuvent être placés plus vers l’avant pour aider à minimiser le mouvement, même si cela peut rendre plus neuromasts postérieure inaccessibles. En outre, après injection de cœur, goupilles de tête peut être tournées afin que la portion horizontale de l’axe se trouve dans le jaune d’oeuf. En plus de modifier la position des goupilles, il est également possible d’utiliser une harpe de cerveau-tranche au lieu de broches pour immobiliser des larves34. Lorsqu’il est placé correctement sur les larves, une harpe est un autre, potentiellement moins invasive méthode d’immobilisation des larves. Alors qu’un déplacement important pouvant résulter de l’épinglage inadéquat, pour effectuer correctement l’injection de cœur de remettre α-bungarotoxine et paralyser les larves peuvent paralysie incomplète, mouvement et entraîner finalement des artefacts de mouvement. Bien que couramment utilisés anesthésiques ont démontré d’influer sur l’excitabilité des cellules ciliées de poisson-zèbre, les travaux récents ont montré que la benzocaïne anesthésique n’interfère pas avec de nombreux aspects de l’activité des cellules ciliées. De même, le plus couramment utilisé anesthésique MS-222 n’interfère avec certains aspects de l’activité de cellules ciliées15. Donc, en raison de la nature difficile de la α-bungarotoxine injection, benzocaïne ou l’application MS-222 peut s’avérer pour être une méthode alternative utile de paralysie pour empêcher tout déplacement chez la larve au cours de l’imagerie fonctionnelle calcique.
Outre les défis techniques impliqués dans le présent protocole, même un échantillon parfaitement monté est inutile si la larve et les cellules ciliées ne sont pas en bonne santé avant et Pendant chaque expérience d’imagerie. Pour s’assurer que les larves et les cellules ciliées sont en bonne santés, il est important que les larves soient maintenus en tampon E3 qui est exempt de débris tels que des chorions (coquilles de œufs), les déchets et les micro-organismes. Bien que la localisation superficielle des cellules de cheveux ligne latérale est avantageuse pour l’imagerie, cet endroit qui les rend plus vulnérables aux lésions cellulaires quand le tampon de l’E3 est encrassé. Un environnement propre et aqueux est particulièrement important pour les jeunes larves (2-4 dpf) ou mutants qui ne peut pas maintenir une nage verticale du poste et se trouvent principalement sur le fond de la boîte de Pétri. Dans ces situations, cellules ciliées ligne latérale et la cupula protectrice qui entoure les faisceaux de cheveux peuvent facilement devenir compromises. Même si à partir de larves saines et les cellules ciliées, tout au long de chaque expérience, il est essentiel de s’assurer que la larve a un rythme cardiaque et la circulation sanguine rapide. Si la circulation sanguine ralentit ou s’arrête, la santé des cellules cheveux peut devenir compromise. Dans les préparations compromises impliquant des larves de malsains ou de la perte du débit sanguin, mourir les cellules de cheveux peut être identifié plusieurs façons : tout d’abord, par l’apparition de karyopyknosis ou de condensation nucléaire, qui se manifeste par une bulle au sein de la cellule sous le systeme optique DIC ; Deuxièmement, en retrait de la cellule et la présence de déplacer rapidement les particules dans le cytoplasme ; et Troisièmement, lorsque les conseils de kinocilia s’écrasent dans différentes directions,35. Lorsque les faisceaux de cheveux est perturbés, la kinocilia écarté ne déplacez pas cohérente ensemble durant la stimulation.
Cette préparation a plusieurs limitations mineures, une étant que la préparation ne reste robuste pour 1 à 3 heures après que, il est établi. Modifications par exemple à l’aide de petites épingles ou une tranche de cerveau harpe pour immobiliser des larves et ajout d’un système de perfusion peut prolonger la durée de vie de cette préparation en vivo . Une autre limitation est que le photoblanchiment et phototoxicité peut survenir après plusieurs essais d’imagerie. Une façon amusante de relever ce défi est d’adapter ce protocole pour la microscopie de lumière-feuille. La microscopie à lumière-feuille est un puissant moyen de réduire de lumière mise au point, entraînant moins de photoblanchiment et phototoxicité36. Ensemble, immobilisation plus douce et moins d’exposition-photo peuvent aider à prolonger chaque séance d’imagerie. Des séances plus d’imagerie permet d’examiner toute la durée des changements fonctionnels qui accompagnent le développement et les processus qui sous-tendent le dégagement des cellules ciliées et régénération après une lésion. Il est important de souligner que, en plus de la microscopie à lumière-feuille, ce protocole peut être adapté à d’autres systèmes confocal types (disque de détection de point 2 photons et filature) ainsi que des systèmes relativement simples widefield28,34 . Dans l’ensemble, sa polyvalence en fait un outil précieux qui peut être adapté et utilisé avec plusieurs systèmes d’imagerie du protocole.
Alors que ce protocole peut être adapté et utilisé avec de nombreux systèmes d’imagerie, pièces du présent protocole peuvent être également adaptées et utilisés (1) avec d’autres indicateurs en plus GCaMP6s et (2) pour l’activité image dans d’autres cellules sensorielles et les neurones au sein du poisson-zèbre larvaire. Par exemple, dans une étude précédente, nous avons utilisé ce protocole se rapportant à l’activité d’image à l’aide de plusieurs indicateurs codés génétiquement au sein de cellules ciliées ligne latérale pour détecter le calcium cytosolique (RGECO1), la fusion des vésicules (SypHy), tension (Bongwoori) de la membrane et membrane calcium (jRCaMP1a-alpha et alpha-GCaMP6s) et au sein de la ligne latérale des processus afférents pour détecter la membrane calcique (GCaMP6s-alpha)5. Basé sur notre expérience à l’aide de ces indicateurs, la lignée transgénique Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) décrit dans ce protocole offre un excellent début pour l’imagerie de l’activité en ligne latérale neuromasts. De tous les indicateurs énumérés ci-dessus, nous avons trouvé que la GCaMP6s est la plus sensible et photostable. Outre ces fonctionnalités, nous mettons en évidence la lignée transgénique Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) parce qu’il peut être utilisé pour faire deux mesures distinctes : cellules ciliées mécanosensibilité et calcium présynaptique au sein d’une seule lignée transgénique.
La technique décrite dans cet article montre comment les imagerie calcique dans la ligne latérale de poisson-zèbre peut être une méthode puissante pour étudier le fonctionnement des cellules ciliées dans leur milieu d’origine. Cette approche est complémentaire à l’étude des mammifères dans les cheveux-cellule fonction est actuellement à l’étude ex vivo des explants. En outre, le modèle de poisson-zèbre peut continuer à être utilisé comme une plateforme pour tester l’efficacité des indicateurs génétiquement codés qui peut être appliqué afin d’examiner l’activité des cellules mammaliennes de cheveux.

Imagerie fonctionnelle calcique est un outil puissant qui peut être utilisé pour surveiller l’activité de plusieurs cellules en même temps1. En particulier, imagerie calcique en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) s’est avéré être avantageux car GECIs peuvent être exprimées de types spécifiques de cellules et par des subcellularly2. Dans la recherche en neurosciences, ces caractéristiques ont fait imagerie calcique en utilisant GECIs une méthode puissante à la fois définir les schémas d’activité au sein des réseaux neurones et mesurer l’influx de calcium aux synapses individuelles3,4. Profitant de ces caractéristiques, une étude récente utilisé la microscopie confocale et GECIs pour surveiller l’activité intracellulaire dans les collections de cellules sensorielles de cheveux5.
Cellules ciliées sont les mécanorécepteurs qui détectent des stimuli sonores et vestibulaires dans l’oreille interne et la circulation locale de l’eau dans le système de la ligne latérale aquatiques vetebrates6,7. Cellules ciliées sont souvent la cible des dommages ou des mutations génétiques qui entraînent la forme la plus courante de perte auditive chez les humains, appelée surdité neurosensorielle perte8,9. Par conséquent, il est essentiel de comprendre le fonctionnement de ces cellules afin de comprendre comment traiter et prévenir la perte d’audition. Pour fonctionner correctement, les cellules de cheveux utilisent deux structures spécialisées appelées faisceaux mécanosensoriels-cheveux et rubans synaptiques de détecter et de transmettre les stimuli, respectivement. Faisceaux de cheveux est situés à l’apex des cellules ciliées et est constitués principalement de saillies fines, semblables à des cheveux appelées stéréocils (Figure 1A). Dans les cellules ciliées vestibulaires et la ligne latérale, chaque paquet de cheveux dispose également d’un seul kinocilium long (CIL seul véritable de la cellule), qui peut s’étendre bien au-delà les stéréocils (Figure 1A). Mécanosensoriels des stimuli dévier les faisceaux de poils, et déflexion met tension liens appelés « pointe-liens » qui interconnectent les stéréocils10. Cette tension s’ouvre mécanotransduction (MET) canaux situés dans les stéréocils, entraînant un afflux apical des cations, y compris le calcium11,12. Cette activité apicale finalement dépolarise la cellule cheveux et ouvre les canaux voltage-dépendants de calcium (Cav1.3) à la base de la cellule. Cav1.3 canaux est trouvés adjacentes aux rubans synaptiques, une structure présynaptique qui longes les vésicules sur les zones actives. Influx de calcium basal par le biais de canauxv1.3 Ca est requis pour la fusion des vésicules, neurotransmission et l’activation des neurones afférents13,14.
Pendant de nombreuses années, les techniques électrophysiologiques comme germes entiers patch de serrage ont été utilisés pour sonder les propriétés fonctionnelles des cellules ciliées de nombreuses espèces, y compris le poisson-zèbre15,16,17, 1819,de,20. Ces enregistrements électrophysiologiques ont été particulièrement utiles dans les domaines de l’ouïe et l’équilibre, car ils peuvent être utilisés pour obtenir des mesures extrêmement sensibles de différentes cellules sensorielles, dont le but est de coder des stimuli extrêmement rapides sur une large gamme de fréquences et les intensités de21,22. Malheureusement, les enregistrements de cellules entières ne peuvent mesurer l’activité des populations de cellules ciliées. Pour étudier l’activité des populations de cellules dans la ligne latérale de poisson-zèbre, potentiel microphonique et des potentiels d’action afférentes ont été utilisés pour mesurer la somme mécanosensibles et les propriétés de réponse postsynaptique de neuromasts individuel23 ,,24. Malheureusement, ni germes entiers enregistrements ni mesures potentielles de champ local ont la résolution spatiale de repérer où l’activité a lieu dans des cellules individuelles ou mesure l’activité de chaque cellule au sein d’une population. Plus récemment, des colorants de calcium et GECIs ont été employés pour contourner ces défis25,26.
Chez le poisson zèbre, GECIs ont prouvé être une approche puissante pour étudier la fonction des cellules cheveux en raison de la relative facilité de création zebrafish transgénique et la clarté optique des larves27. Chez les larves de poisson zèbre, les cellules ciliées sont présents dans l’oreille interne, mais aussi le système de la ligne latérale. La ligne latérale est composée de grappes de rosette-comme des cellules ciliées appelés neuromasts qui sont utilisés pour détecter les modifications locales dans le mouvement de l’eau (Figure 1). La ligne latérale est particulièrement utile car il est situé à l’extérieur le long de la surface du poisson. Cet accès a permis de stimuler les cellules ciliées et de mesurer les signaux calciques optiquement en larves intactes. Dans l’ensemble, la facilité de la transgénèse, transparence des larves et l’accès sans précédent des cellules ciliées ligne latérale ont fait poisson-zèbre, un modèle précieux pour étudier l’activité des cellules ciliées in vivo. Il s’agit d’un avantage significatif par rapport aux systèmes mammaliens dans lequel cellules ciliées sont entourés par des structures osseuses de l’oreille interne. Ce manque d’accès a rendu très difficile d’acquérir fonctionnelles mesures in vivo des cellules de mammifères cheveux.
Le protocole décrit ici décrit comment surveiller les modifications de fonction canal et presynapse MET en calcium dans les cellules individuelles de cheveux et les cellules au sein de le neuromasts chez le poisson zèbre larvaire. Ce protocole utilise une ligne établie zebrafish transgénique qui exprime une GCaMP6s membrane localisée sous le contrôle du promoteur cheveux-cellule spécifique myosin6b 28. Cette localisation de la membrane des postes GCaMP6s pour détecter les influx de calcium par le biais de canaux ioniques, situé dans la membrane plasmique qui sont critiques pour la fonction de cellules ciliées. Par exemple, GCaMP6s membrane localisée peut détecter calcium influx par MET les chaînes en faisceaux de poils apicale et grâce à CaV1,3 chaînes près de rubans synaptiques à la base de la cellule. Cela contraste avec l’aide de GECIs localisées dans le cytosol, comme GECIs cytosoliques détecter les signaux calciques qui sont une combinaison de MET et CaV1.3 l’activité ainsi que les contributions de calcium provenant d’autres sources (par exemple, magasin de sortie). Ce protocole décrit comment immobiliser et paralyser les larves transgéniques GCaMP6s avant l’imagerie. Il décrit ensuite comment préparer et utiliser un jet fluide pour faire dévier les ballots de cheveux afin de stimuler les cellules ciliées ligne latérale d’une manière contrôlée et reproductible. Des données représentatives qui peuvent être réalisées à l’aide de ce protocole sont présentées. Exemples de données qui représentent des artefacts de mouvement sont également présentés. On décrit des expériences de contrôle qui sont utilisés pour vérifier les résultats et exclure les artefacts. Enfin, on décrit une méthode pour visualiser les signaux de calcium spatiale dans le logiciel de Fidji. Cette analyse de Fidji est une adaptation de méthodes de visualisation établie précédemment développées à l’aide de MATLAB5. Dans l’ensemble, ce protocole présente une technique de préparation puissante qui utilise GECIs chez le poisson zèbre larvaire pour mesurer et visualiser la dynamique du calcium in vivo de cellules ciliées.

<table><tbody><tr><td><forte>Section 1</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-Bungarotoxine</td><td>R& D Systems</td><td>2133</td><td>Pour paralyser les larves avant l’imagerie Rouge de</td></tr><tr><td>phénol Solution 0,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Pour la visualisation d’une solution de &alpha ;-bungarotoxine pendant l’injection cardiaque</td></tr><tr><td>Méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (MESAB, MS-222, tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Pour l’anesthésie des larves</td></tr><tr><td><fortes>Section 2</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’imagerie</td><td>Siskiyou</td><td>PC-R</td><td>Plate-forme pour monter les larves pour l’imagerie</td></tr><tr><td>N° 1.5 Lamelles carrées, 22*22 mm</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Pour sceller la chambre d’imagerie&nbsp ;</td></tr><tr><td>Graisse silicone sous vide poussé</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-635-5D&nbsp ;</td><td>Pour la fixation de lamelles sur la chambre d’imagerie</td></tr><tr><td>Silicone encapsulant transparent 0,5 g kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td>Pour remplir la chambre d’imagerie afin de créer une surface pour épingler les poissons&nbsp ;</td></tr><tr><td>Four</td><td>Techne</td><td>HB-1D</td><td>Pour le séchage de l’encapsulant en silicone</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>Stemi 2000 avec éclairage en lumière transmise</td><td>Pour éclairer le fil, les pinces et les ciseaux pour faire des épingles</td></tr><tr><td>Pinces fines Pinces</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Réf. 11295-10</td><td>Pour la fabrication d’épingles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux fins&nbsp ;</td><td>Cole-Palmer</td><td>5.5", EW-10818-00</td><td>Pour couper du fil de tungstène pour faire des broches</td></tr><tr><td>Fil de tungstène, 0,035 mm</td><td>Goodfellow</td><td>W005131</td><td>Pour des goupilles de tête pour immobiliser les larves</td></tr><tr><td>Fil de tungstène, 0,025 mm</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AA10405-H4</td><td>Pour des goupilles de queue pour immobiliser les larves</td></tr><tr><td><fort>Section 3</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gouleur</td> <td>à micropipetteSutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td>Pour tirer le verre capillaire pour les aiguilles d’injection à jet de fluide et cardiaque</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté avec filament</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>BF 150-86-10</td><td>Verre à aspirer dans les aiguilles d’injection de &alpha ;-bungarotoxine pour l’injection cardiaque</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté sans filament</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B 150-86-10</td><td>Verre à tirer dans des aiguilles à jet fluide pour stimuler les cellules ciliées</td></tr><tr><td>Polisseuse à pipette</td><td>Narishige</td><td>MF-830 microforge</td><td>Pour polir les pointes de pipette à jet de fluide pour lisser les ruptures irrégulières</td></tr><tr><td>Carreaux de céramique</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>NC9569052</td><td>Pour marquer et casser en soirée les aiguilles à jet fluide&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sections 4 & 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Réf. 11295-10</td><td>Pour l’épinglage des larves</td></tr><tr><td>Embouts de chargement de gel</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Pour le remplissage des aiguilles d’injection cardiaque</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>Stemi 2000 avec éclairage en</td> <td>lumière transmisePour éclairer les larves pendant l’épinglage et l’injection du cœur</td></tr><tr><td>Porte-capillaire/aiguille en verre</td><td>WPI</td><td>MPH315</td><td>Pour tenir les aiguilles à jet de fluide</td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Pour tenir et positionner le porte-aiguille pour injecter de l’alpha ;-bungarotoxine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td>Pour tenir un micromanipulateur manuel pour l’injection de &alpha ;-bungarotoxine</td></tr><tr><td>Injecteur de pression</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet 4x</td><td>Pour administrer de la &alpha ;-bungarotoxine</td></tr><tr><td><forte>Sections 6, 7 & 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Bruker</td><td>Swept</td> <td>field/OpterraMicroscope fixe et droit avec optique DIC et laser 488 nm avec filtres appropriés</td></tr><tr><td>Logiciel de microscope</td><td>Bruker</td><td>Prairieview 5.3</td><td>Pour coordonner et contrôler le microscope, les lasers, la platine, le piézo-z, les caméras et l’objectif</td></tr><tr><td>à jet de fluide 10x</td><td>Nikon</td><td>MRH00101</td><td>Faible grossissement pour le positionnement des larves et objectif</td></tr><tr><td>à jet de fluide 60x</td><td></td> Nikon <td>MRF07620</td><td>Objectif immergé dans l’eau avec ouverture numérique élevée (1,0) et distance de travail adéquate (2,0 mm)</td></tr><tr><td>Scanner d’objectif Piezo-Z avec contrôleur/pilote</td><td>Instruments Physik Intruments/Bruker</td><td>01144210/UM-Z-PZ</td><td>Acquisition z-stack haute vitesse avec une précision de 0,025um</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD&nbsp ;</td><td>QImaging</td><td>Rolera EM-C2 Caméra EMCCD&nbsp ;</td><td>Appareil photo avec une petite taille de pixel qui peut acquérir jusqu’à 100 images par s</td></tr><tr><td>Adaptateur de chambre circulaire</td><td>Siskiyou</td><td>PC-A</td><td>Pour maintenir et faire pivoter la chambre d’imagerie sur la platine de microscope</td></tr><tr><td>Platine motorisée à pont Z</td><td>ZDN12MP scientifique Prior</td><td></td><td>Platine de microscope capable de contenir et de déplacer l’échantillon et micromanipulateur avec aiguille à jet de fluide ensemble Adaptateur d’insert</td></tr><tr><td>de platine en Z</td><td>NIH Atelier d’usinage</td><td>personnalisé</td><td>Pour monter l’adaptateur de chambre circulaire sur la platine</td></tr> <tr><td>à pont en ZAppareil à jet de fluide</td><td>Instruments scientifiques ALA</td><td>HSPC-1 Pince à pression à grande vitesse avec PV-PUMP</td><td>Pour le contrôle et la distribution du stimulus de jet de fluide</td></tr><tr><td>Tube en silicone durci au peroxyde Masterflex (1 pieds)</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex L/S 13, 96400-13</td><td>Pour connecter le porte-aiguille à jet de fluide à la pompe à pression</td></tr><tr><td>Micromanipulateur motorisé</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>MP-225</td><td>Pour le maintien et le positionnement du porte-aiguille pour jet de fluide&nbsp ;</td></tr><tr><td>Contrôleur de micromanipulateur</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>MPC-200</td><td>Pour la commande d’un manipulateur d’aiguille à jet de fluide</td></tr><tr><td>Conseils de chargement de gel</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Pour le remblayage d’aiguilles à jet de fluide</td></tr><tr><td>Porte-capillaire/aiguille en verre</td><td>WPI</td><td>MPH315</td><td>Pour tenir les aiguilles à jet de fluide</td></tr><tr><td>Manomètre PSI</td><td>Sper Scientific</td><td>840081</td><td>Pour mesurer la sortie de la pince de pression</td></tr><tr><td>Section 9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAPTA, sel tétrapotassique, imperméable aux cellules</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>B1204</td><td>Pour cliver les pointes des liens, découpler les canaux MET et bloquer tous les signaux GCaMP6s évoqués</td></tr><tr><td>Isradipine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6658</td><td>Pour bloquer les signaux dépendant des canaux calciques de type L (CaV1.3) au niveau de la DMSO</td></tr> <tr><td></td><td>présynaptiqueSigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Solvant pour composés pharmacologiques</td></tr><tr><td>Section 10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism7</td><td>Graphpad</td><td>Prism7 Logiciel</td><td>pour tracer les changements d’intensité du GCaMP6</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Schindelin, et., al.34</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Logiciel pour traiter des images et créer des cartes de signaux spatio-temporels</td></tr><tr><td>Turboreg Plugin</td><td>Th&eacute ; Venaz et., al.29&nbsp ;</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>Plugin pour enregistrer les séquences d’images GCaMP6 dans FIJI</td></tr><tr><td>StackReg Plugin</td><td>Th&eacute ; venaz et., al.29</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>Plugin pour enregistrer les séquences d’images GCaMP6 dans FIJI</td></tr><tr><td>Times Series Analyzer V3 Plugin</td><td>Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td>Plugin pour créer plusieurs ROI pour mesurer les changements d’intensité de GCaMP6</td></tr></tbody></table>

en imagerie calcique vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Des cellules ciliées sensorielles sont les mécanorécepteurs dans l’oreille interne qui sont requises pour l’ouïe et l’équilibre. Cellules ciliées sont activés en réponse à des stimuli sensoriels qui mécaniquement faire dévier apicales protubérances appelées faisceaux de cheveux. Déflexion ouvre la mécanotransduction (MET) canaux en faisceaux de poils, conduisant à un afflux de cations, y compris le calcium. Cet afflux de cation dépolarise la cellule et ouvre les canaux calciques voltage-dépendants situés à la base à la presynapse des cellules ciliées. Chez les mammifères, les cellules ciliées sont encastrées dans les os, et c’est difficile à évaluer sur le plan fonctionnel ces activités in vivo. En revanche, zebrafish larvaire sont transparent et possèdent un organe situé à l’extérieur de ligne latérale qui contient les cellules ciliées. Ces cellules ciliées sont fonctionnellement et structurellement semblables aux cellules mammifères de cheveux et peut être évaluées sur le plan fonctionnel in vivo. Cet article présente une technique qui utilise un indicateur de calcium génétiquement encodé (GECI), GCaMP6s, de mesurer le calcium induite par stimulation des signaux dans les cellules ciliées de poisson-zèbre-la ligne latérale. GCaMP6s peut être utilisé, ainsi que l’imagerie confocale, pour mesurer des signaux de calcium in vivo à l’apex et la base des cellules ciliées de ligne latérale. Ces signaux offrent une lecture en temps réel et quantifiable de ces deux activités de calcium dépendante mécanosensibilité et presynapse au sein de ces cellules ciliées. Ces signaux calciques fournit également des informations fonctionnelles importantes au sujet de comment les cellules ciliées détecter et transmettre les stimuli sensoriels. Dans l’ensemble, cette technique génère des données utiles sur les changements relatifs à l’activité de calcium in vivo. Il est moins bien adapté pour la quantification de la magnitude absolue des changements de calcium. Cette technique in vivo est sensible aux artefacts de mouvement. Une quantité raisonnable de pratique et des compétences sont nécessaires pour un positionnement correct, immobilisation et la stimulation des larves. En fin de compte, lorsqu’il est correctement exécuté, le protocole décrit dans cet article fournit un puissant moyen de recueillir des informations précieuses sur l’activité des cellules ciliées dans leur état naturel et totalement intégré au sein d’un animal vivant.

Le poisson-zèbre est un système de modèle qui possède de nombreuses fonctionnalités utiles y compris la clarté optique, rapide développement externe et, d’une importance particulière pour le domaine de l’ouïe et l’équilibre, extérieurement situé des cellules ciliées sensorielles. Cet article décrit comment transgénique zebrafish permet de doser la mécanosensibilité cellulaire-cheveux et la fonction présynaptique dans sa totalité.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l’audition et de l’équilibre. Il décrit comment détecter deux aspects importants de la fonction des cellules capillaires sensorielles, la mécanotransduction et l’activité présynaptique. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nous permet de visualiser la fonction des cellules cils chez un animal vivant, et d’étudier comment les collections de cellules cils détectent et transmettent des informations sensorielles.Pour commencer cette procédure, utilisez des forceps fins et du fil de tungstène pour façonner les broches à utiliser pour immobiliser la larve à travers la tête et la queue, sur l’encapsulant durci. Pour faire des épingles à tête, maintenez un morceau de fil de tungstène de 0,035 millimètre dans une main. À l’aide de forceps fins dans l’autre main, plier le fil d’un millimètre vers le haut de l’extrémité, à 90 degrés.Échangez les forceps contre des ciseaux fins, et coupez un millimètre après le virage, pour créer la goupille. Ensuite, utilisez des forceps pour insérer les broches dans l’encapsule durci sur la chambre. Placez la larve au centre de la chambre de perfusion de sorte qu’elle se trouve à plat sur le côté contre l’encapsulant en silicone.À l’aide de forceps fins, apportez la goupille de tête de 0,035 millimètre vers le bas perpendiculairement à la larve. Insérez la goupille de tête entre l’oeil et la vésicule otic, et vers le bas dans l’encapsulant. Utilisez un deuxième ensemble de forceps pour stabiliser la larve le long de son côté dorsale et ventral, tout en épinglant.Assurez-vous que la partie horizontale de la goupille entre en contact avec la larve et n’appuie pas tout le chemin dans l’encapsulant. Inclinez la goupille ventrally, ou pointant légèrement vers l’antérieur de la larve, pour éviter d’interférer avec l’injection cardiaque suivante et l’imagerie cellulaire de cheveux. À l’aide des forceps, insérez une goupille arrière de 0,025 millimètre dans le notochord, aussi près que possible de l’extrémité de la queue.Pour injecter de l’alpha bungarotoxine dans la larve, remplissez trois microlitres de la solution dans l’aiguille d’injection, à l’aide d’une pointe de pipette à chargement de gel. Chargez la solution uniformément à la pointe, sans bulles. Insérez ensuite l’aiguille d’injection cardiaque dans un porte-pipette fixé à un micromanipulateur manuel.Sous un microscope stéréo, placez l’aiguille de façon à ce qu’elle soit alignée perpendiculairement à l’axe AP de la larve anesthésiée, pointant vers le bas à un angle de 30 degrés. Ensuite, connectez le support pipette à l’injecteur de pression. Injectez un bolus d’alpha bungarotoxin dans la solution, pour tester si la pointe de l’aiguille est claire.Si aucune couleur rouge n’est vue, grattez très doucement la pointe de l’aiguille contre le bord d’une goupille, et réessayer, jusqu’à ce que l’aiguille soit claire. Par la suite, avancez l’aiguille vers le cœur, jusqu’à ce qu’elle touche la peau à l’extérieur du cœur. Appuyez sur l’aiguille dans la larve, et chercher l’indentation de la cellule pigmentaire sur la peau en face du cœur pour s’assurer que l’aiguille est positionnée dans le plan correct, par rapport à la larve.Ensuite, avancez l’aiguille plus loin, jusqu’à ce qu’elle perce la peau et pénètre dans la cavité cardiaque. Tirez légèrement l’aiguille vers l’arrière et injectez un bolus d’alpha bungarotoxine dans la cavité cardiaque. Recherchez l’inflation de la cavité cardiaque, ou pour le colorant rouge entrant dans la cavité.Rincez doucement la larve trois fois, avec un millilitre de tampon neuronal pour enlever le MS222 résiduel. N’enlevez jamais tout le liquide. Maintenir la larve dans environ 1 millileter de tampon neuronal dans la chambre de perfusion.Dans cette procédure remblayer 10 microlitres de tampon néonal dans une aiguille fluide-jet correctement cassée à l’aide d’une pointe de chargement de gel. Chargez la solution uniformément à la pointe sans bulles. Ensuite, insérez l’aiguille dans le porte-pipette fixé au micromanipulateur motorisé.Placez la chambre de perfusion dans un adaptateur circulaire de chambre sur l’étape de microscope. Déplacez la scène motorisée de sorte que la larve soit au centre du champ de vision. Par la suite, tournez l’adaptateur circulaire de chambre de sorte que l’accès d’AP à la larve soit approximativement aligné avec la trajectoire de l’aiguille fluide-jet.À l’aide de la lumière transmise et du contraste différentiel des interférences, mettre la larve au point et la centrer sous l’objectif 10x. Ensuite, augmenter l’objectif 10x. À l’aide du micromanipulateur motorisé, amener l’aiguille à jet fluide au centre du champ de vision, de sorte qu’elle est éclairée par la lumière transmise et touche à peine le tampon neuronal.Abaissez l’objectif 10x de se concentrer sur la larve afin de confirmer son emplacement. Fuous l’objectif sur l’aiguille fluide-jet. Déplacez l’aiguille à jet fluide avec le micromanipulateur dans l’axe x et y jusqu’à ce qu’elle soit en position parallèle au côté dorsale de la larve.Ensuite, concentrez-vous sur la larve. Amenez l’aiguille dans l’axe Z et placez l’aiguille le long du côté dorsale du poisson, à 1 millimètre du corps. Déplacez soigneusement l’adaptateur circulaire de chambre pour s’assurer que l’aiguille fluide de jet est alignée le long de la ligne médiane d’AP de la larve.Ensuite, passez à l’objectif 60x eau. Assurez-vous que l’objectif est emersed dans le tampon neuronal. Utilisez la mise au point fine pour localiser un neuromast.Déplacez ensuite l’étape motarisée pour placer le neuromast d’intérêt au centre du champ de vision. Gardez la pointe fluide de l’aiguille du jet le long du côté dorsal du poisson. Ne touchez pas la pointe de l’aiguille du jet fluide à la larve ou à la surface de la chambre.Placez l’aiguille à jet fluide avec le micromanipulateur de sorte qu’elle soit à 100 micromètres du bord externe du neuromast. Ensuite, concentrez-vous jusqu’à l’extrémité des faisceaux de cheveux apical. Le fond de l’aiguille fluide-jet doit être au point dans cet avion.Réglez la pince de pression à grande vitesse du manuel au mode externe pour recevoir l’entrée du logiciel d’imagerie. Zéro la pince de pression à grande vitesse en appuyant sur le bouton zéro, et utilisez le bouton de point de réglage pour régler la pression de repos légèrement positive. Confirmez la sortie de repos de la pince à pression à grande vitesse à l’aide d’un manomètre PSI fixé à la sortie de l’étage de tête.Pour déterminer la pression nécessaire pour stimuler les faisceaux de cheveux, appliquez un stimulus d’essai avec une sortie de 0,125 et 0,25 volt pendant 200-500 millisecondes. Pour chaque stimulus d’essai, mesurer la distance de déflexion des extrémités des brosses à cheveux, la kinocilia. Choisissez une pression qui déplace les faisceaux sur une distance d’environ 5 micromètres.Assurez-vous que les extrémités de la kinocilia restent au point tout le temps. Pour acquérir des images mono-plan, sélectionnez un stimulus à livrer lors de l’acquisition de 80 images, après le cadre 30, à 3 secondes. Pour mesurer les réponses mécanosensibles au calcium, concentrez-vous sur la base des faisceaux de cheveux apical et commencez l’acquisition d’images.Pour mesurer les réponses présynaptiques en calcium, concentrez-vous à la base des cellules cils et commencez l’acquisition d’images. Les étapes pour visualiser les changements spatiotemporaux de l’intensité de GCaMP6S, dans un neuromast pendant la simulation, sont décrites ici. Le temps est représenté de gauche à droite selon l’horodatage.La rangée supérieure montre cinq des quatorze bacs temporels d’une séquence d’image GCaMP6S F de 70 images. Dans la deuxième rangée, la ligne de base a été supprimée de chaque image binned GCaMP6S F pour créer des images delta F. Dans la troisième rangée, les images delta F ont été converties de l’échelle grise à la table de regard rouge chaud.Dans la rangée inférieure, la troisième rangée a été superposée sur les images F dans la rangée supérieure. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que la larve est épinglée correctement et d’utiliser les contrôles appropriés, comme décrit dans le manuscrit pour exclure les artefacts de mouvement de vos données. Travailler avec de l’alpha bungarotoxine peut être dangereux.Il est important de prendre des précautions, comme le port de gants pendant sa manipulation.

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Le but de cette vidéo est de montrer les procédures d'obtention de cellules saines intactes cheveux des organes de l'oreille interne du poisson zèbre adulte, puis de les utiliser pour les études de patch-clamp visant à caractériser les propriétés biophysiques de leurs canaux voltage-dépendants.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Cette vidéo montre la méthode d’étude de la détection visuelle des proies chez les larves de poisson-zèbre transgénique à l’aide de l’imagerie fluorescente basée sur des indicateurs calciques avec leurs neurones exprimant des complexes indicateurs de calcium fluorescents.

Analyse de l’activité neuronale évoquée par la proie chez une larve de poisson-zèbre transgénique

Cette vidéo montre l’enregistrement des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre paralysée en positionnant une micropipette près du ganglion de la ligne latérale et en formant un joint lâche pour la capture du signal. La solution extracellulaire maintient la viabilité neuronale pendant ce processus.

Surveillance des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre immobilisée

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Imagerie in vivo du cerveau d’une larve de poisson-zèbre pour visualiser les neurones cérébelleux

Source : Lukasz, D., et al. Imagerie calcique in vivo des cellules ciliées de la ligne latérale chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre l’imagerie en direct de l’afflux de calcium dans les cellules ciliées de la ligne latérale d’une larve de poisson-zèbre transgénique paralysée à l’aide d’un microscope confocal. La stimulation mécanique des faisceaux de cheveux par des impulsions fluides induit l’entrée du calcium par les canaux de mécanotransduction et les...

Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules ciliées de la ligne latérale des larves de poisson-zèbre

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Nous présentons ici une méthode pour imager le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre in vivo jusqu’aux stades larvaire et juvénile. Cette procédure micro-invasive, adaptée des approches électrophysiologiques, donne accès aux détails cellulaires et subcellulaires des neurones matures et peut être combinée avec des études optogénétiques et neuropharmacologiques pour caractériser la fonction cérébrale et l’intervention médicamenteuse.

Imagerie in vivo de tissu cérébral entièrement actif chez des larves et des juvéniles de poissons-zèbres éveillés par enlèvement du crâne et de la peau

Nous décrivons un protocole pour surveiller des changements de l’activité afférente de neurone pendant des commandes de moteur dans un système de cellules de cheveux vertébré modèle.

Activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure pendant la baignade chez le poisson zèbre

Un protocole d’imagerie in vivo du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle est présenté ici. La procédure expérimentale comprend la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et la visualisation.

In vivo Imagerie du cerveau entier de larves de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie à fluorescence tridimensionnelle

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.

In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

Découvrez l'imagerie calcique in vivo des cellules ciliées chez Danio rerio larvaire. Cette méthode permet de visualiser la mécanotransduction et l'activité présynaptique pour étudier l'audition et l'équilibre.

En imagerie calcique Vivo des cellules ciliées ligne latérale chez le poisson zèbre larvaire

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