Préparation des Exosomes des siARN livraison aux cellules cancéreuses

La récolte d’un milieu conditionné enrichi en exosome à partir de cellules cultivés dans des flacons bioréacteurs et l’isolement par ultracentrifugation coussin saccharose entraînent une préparation exosome à haut rendement avec des protéines contaminantes minimales ou des vésicules non exosomales. L’utilisation d’un coussin de saccharose unique préparé dans l’oxyde de deutérium contourne la préparation laborieuse d’un gradient de saccharose discontinu et réduit la quantité de saccharose nécessaire pour atteindre la densité requise. La livraison in vitro efficace de siRNA encapsuler dans les exosomes préparés dans ce protocole accentue le potentiel de ce système en tant que thérapie basée sur l’interférence d’ARN de nouvelle génération pour le cancer pancréatique.

Pour commencer, la culture HEK-293 cellules dans le milieu normal, comme décrit dans le manuscrit. Étendre les cellules en quatre flacons T75, et se développer jusqu’à ce qu’ils atteignent 90% confluent. Pour préparer un flacon de bioréacteur, ajouter de 50 à 100 millilitres de milieu normal dans le réservoir moyen du flacon de bioréacteur pour mouiller la membrane.

Recueillir toutes les cellules HEK-293 des quatre flacons T75, et les résusquer en 15 millilitres de milieu exosome-épuisé dans un tube de centrifugeuse. Ensuite, utilisez une seringue de 20 millilitres reliée à une aiguille de remplissage contondante pour ajouter soigneusement cette suspension cellulaire au compartiment cellulaire du flacon de bioréacteur. Ensuite, remplissez le réservoir moyen de la fiole du bioréacteur avec le milieu normal, jusqu’à 500 millilitres, et incubez-le à 37 degrés Celsius, 5% de CO2 pendant une semaine.

Après une semaine d’incubation, retirer tout le milieu du réservoir moyen du flacon de bioréacteur en le versant. À l’aide d’une seringue de 20 millilitres reliée à une aiguille de remplissage contondante, retirez tout le milieu du compartiment cellulaire. Ajouter ensuite 50 à 100 millilitres de milieu normal au réservoir moyen et 15 millilitres de milieu frais appauvri en exosome au compartiment cellulaire à l’aide d’une seringue de 20 millilitres reliée à une aiguille de remplissage contondante.

Ensuite, remplissez le réservoir moyen du flacon de bioréacteur avec un milieu normal jusqu’à 500 millilitres. Incuber à 37 degrés Celsius, 5% de CO2 pour une autre semaine. Pour pré-effacer le milieu conditionné recueilli, centrifuger à 500 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Transférer le surnatant dans un nouveau tube et jeter la pastille. Après avoir répété cette étape de centrifugation avec le supernatant récupéré, récupérer le supernatant à nouveau et jeter la pastille. Puis, centrifugeuse le supernatant récupéré à 2000 fois g pendant 15 minutes et quatre degrés Celsius.

Gardez le surnatant et jetez la pastille. Filtrer le supernatant une fois à travers un filtre de 22 micromètres fixé à une seringue de 20 millilitres dans un tube de centrifugeuse fraîche. Pendant ce temps, pour préparer une solution de saccharose de 25% dans l’oxyde de deutérium, peser avec précision 1,9 grammes de saccharose dans un tube universel.

Ajouter ensuite l’oxyde de deutérium jusqu’à ce que le poids atteigne 7,6 grammes. Ensuite, remplissez un tube d’ultracentrifugeuse avec 22,5 millilitres de milieu conditionné pré-dégagé. Placer une pipette en verre dans le tube.

Ajouter trois millilitres de solution de saccharose à travers la pipette de sorte que la solution forme une couche séparée sous le milieu conditionné. Placez soigneusement le tube contenant une solution moyenne/saccharose conditionnée en couches dans le seau d’un rotor échangiste. Fixez le seau dans le rotor.

Placez le rotor dans l’ultracentrifugeuse, et tournez à 100 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 1,5 heure. Recueillir deux millilitres de la couche de saccharose du tube, un millilitre à la fois à l’aide d’une pipette P1000, avec sa pointe attachée à une pointe de 10 microlitres, et l’ajouter à une bouteille d’ultracentrifugeuse contenant 20 millilitres de PBS filtré pour le lavage. Placez le tube dans un rotor à angle fixe, et centrifugez-le à 100 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 1,5 heure.

Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour enlever soigneusement le surnatant. Resuspendez la pastille avec 400 microlitres de PBS filtré. Avant de commencer l’électroporation, pré-refroidir la cuvette d’électroporation sur la glace pendant 30 minutes.

Mélanger sept microgrammes d’exosomes avec 33 microgrammes de siRNA dans le tube de microcentrifugeuse. Ajouter tampon acide citrique pour atteindre le volume de 150 microlitres. Ajouter le mélange exosome-siRNA à la cuvette d’électroporation à l’aide d’une pipette en plastique et capuchon de la cuvette.

Placez la cuvette dans la bonne orientation dans le support de cuvette de l’électroporateur, et faites pivoter la roue de rotation de l’électroporateur à 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre. Sélectionnez le programme désiré et appuyez sur le bouton Démarrer pour commencer l’électroporation. L’affichage indiquera une impulsion réussie.

Ensuite, tournez en arrière de la roue à 180 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, et retirez la cuvette. Utilisez une pipette en plastique pour retirer l’échantillon de la cuvette dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Conserver le tube sur la glace ou au réfrigérateur avant d’être traité plus avant, s’il n’est pas utilisé immédiatement.

Pour commencer l’enlèvement libre de siRNA, passez 3.5 millilitres de PBS filtré par la colonne de chromatographie d’exclusion de taille deux fois pour l’équilibrer. Ensuite, dissoudre 150 microlitres d’échantillon électroporé dans 350 microlitres de PBS filtré, et le transférer à la colonne SEC. Recueillir la première fraction de 500 microlitres élisée de la colonne dans un tube de microfuge, et le marquer comme F0. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS filtré à la colonne.

Collecter la fraction suivante, et la marquer comme F1. Répétez l’ajout du PBS et la collecte des fractions d’élitution jusqu’à ce qu’un total de 10 fractions de 500 microlitres, ou jusqu’à F9, soit collecté. Enfin, pour éliminer les résidus d’échantillons, lavez la colonne avec du PBS filtré au moins deux fois, puis poursuivez les expériences, telles que décrites dans le manuscrit. L’analyse morphologique utilisant la microscopie électronique de transmission a prouvé que les exosomes HEK-293 étaient des structures sphériques légèrement plus grandes que 100 nanomètres.

Ce résultat est d’accord avec celui de la mesure d’analyse de suivi des nanoparticules, qui a également montré la répartition de la taille des exosomes. En outre, ils étaient positifs pour les marqueurs exosomaux CD81, CD9 et CD63. Le rétablissement en pourcentage des exosomes purifiés à l’aide de la chromatographie d’exclusion de taille et le rétablissement en pourcentage du siRNA ont été calculés comme décrit dans le manuscrit.

La récupération post-purification de l’exosome était de 75% Utilisant la courbe standard de siRNA, l’efficacité d’encapsulation du siRNA dans les exosomes a été calculée pour être environ 10 à 20%Analyse qualitative de cytométrie de flux de l’absorption in vitro des exosomes chargés avec l’Atto655-siRNA fluorescent a prouvé que les cellules PANC-1 traitées avec des exosomes siRNA-encapsulés ont eu le plus grand décalage dans le signal de fluorescence. Cela a été confirmé par la conclusion que les cellules PANC-1 traitées avec des exosomes siRNA-encapsulés ont enregistré un pourcentage plus élevé de positif de population pour le signal d’Atto655 comparé à celui traité avec les exosomes déchargés et le mélange de siRNA. L’absorption cellulaire du siRNA était également sensiblement plus élevée dans les cellules PANC-1 traitées avec des exosomes siRNA-encapsulés comparés à ceux traités avec le mélange exosome-siRNA, confirmant que les exosomes siRNA-encapsulés ont été internalisés par les cellules PANC-1 et qu’ils fournissent effectivement le siRNA intracellulairement.

Il est important de peser le saccharose et l’oxyde de deutérium très précisément lors de la préparation de la solution de saccharose, et toujours utiliser la solution de saccharose fraîchement préparé pour éviter l’altération de la densité pendant le stockage. La microscopie confocales peut être effectuée pour valider davantage l’internalisation du siRNA encapsulé dans les exosomes en cellules et étudier son trafic intracellulaire après l’absorption cellulaire. Ce protocole nous permet d’évaluer le knockdown spécifique aux gènes du siRNA livré par exosome et sert d’outil pour la validation de nouvelles cibles dans le traitement du cancer basé sur l’interférence arn.