Manutention et évaluation de la Culture humaine Organoïde la Prostate primaire

Nous présentons ici un protocole visant à guider la manipulation humaine primaire organoïde la prostate puis indiquent les points de terminaison pour évaluer le phénotype. Semis, entretien de la culture, recouvrement de gel de matrice, quantification morphologique, enrobage et sectionnement, FFIP sectionnement, entier-montez coloration et application d’essais commerciaux sont décrites.

Les organoïdes de la prostate sont un système in vitro passionnant pour étudier le développement et la maladie. Ils surmontent les défis des lignées cellulaires immortalisées et offrent une alternative peu coûteuse aux modèles animaux. Ils peuvent être cultivés à partir de cellules de la prostate humaine, comme nous l’avons montré dans ce protocole, ainsi que les cellules de la prostate de souris, comme un système de modèle préclinique pertinent pour la maladie.

De nombreux laboratoires ont décrit des méthodes de culture et des critères d’évaluation utiles. Mais nous espérons réunir ces détails dans un protocole et démontrer les étapes particulièrement difficiles pour les nouveaux utilisateurs. Au fur et à mesure que les techniques s’améliorent, les organoïdes du cancer de la prostate peuvent être cultivés à partir d’échantillons de patients comme approche de la médecine de précision pour modéliser la maladie et la réponse aux thérapies.

Les conditions de culture sont spécifiques aux organoïdes de la prostate, mais beaucoup de critères d’évaluation ont été adaptés à partir d’autres types de tissus. Un utilisateur peut adapter des parties de ce protocole à son type d’intérêt cellulaire. Commencez cette expérience en cultivant des cellules épithéliales dans des plaques matricielles codées en gel de 96 puits telles que décrites dans le manuscrit.

Pour recueillir les organoïdes dans les assiettes après 12 jours, retirer le milieu des puits sans perturber le gel matricielle. Ajoutez immédiatement environ 200 microlitres de protéase neutre à chaque puits à environ un rapport d’un à deux gel matriciel à la protéase neutre. Incuber la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Puis pipette de haut en bas pour dissocier mécaniquement le mélange, et incuber à nouveau pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, transférer le mélange gel-cellule de matrice de protéase neutre de quelques puits à un tube de microcentrifugeuse. Pelleter les cellules par centrifugation à 300 fois g pendant trois à cinq minutes.

Retirez le supernatant et enregistrez la pastille organoïde pour des analyses ultérieures. Pour créer des moules pour l’intégration, découpez une petite section d’une pointe de pipette de 1000 microlitres pour faire un cylindre qui contient 50 microlitres. Puis de la partie la plus large de la même pointe, faire un deuxième moule plus large qui s’adapte autour du premier moule.

Pour créer un bloc froid, enveloppez un sac de glace avec du ruban adhésif vers le haut. Ensuite, adhérer les moules perpendiculairement à la bande. Pour intégrer les organoïdes dans une fiche de gel d’histologie pour le traitement, lavez d’abord la pastille organoïde précédemment obtenue avec un millilitre de solution de sel équilibré de Hank.

Après avoir centrifugé à 300 fois g pendant trois à cinq minutes, retirer le surnatant. Ajouter ensuite 30 à 50 microlitres de gel d’histologie liquide à la pastille organoïde, et mélanger doucement en pipetting lentement de haut en bas pour résuspendre la pastille. Transférer ce mélange dans un moule sur le bloc froid, et permettre à l’échantillon de refroidir et de solidifier dans un bouchon.

Ensuite, utilisez un piston pour pousser la fiche hors du petit moule et dans le centre du moule plus grand, et le remplir en pipetting clair 2% agar autour de la fiche. Pour marquer le dessus de l’échantillon, pipette histologique teintée de colorant 2% agar sur le dessus de la fiche. Une fois l’agar refroidi, utilisez un piston pour transférer la fiche dans une cassette d’histologie.

Étiquetez la cassette avec un crayon et placez-la dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pour la fixation pendant la nuit. Le lendemain, transférez la cassette de la formaline tamponnée neutre à 70 % d’éthanol de qualité histologique, et la traiter davantage et l’intégrer dans la paraffine. Commencez par couper la base du bloc à une épaisseur de 10 micromètres.

Une fois qu’une section contenant la zone de prise apparaît, arrêtez de tailler. Verrouillez le rotor de microtome et transférez le bloc sur la glace pour le refroidir. Déplacez la lame vers une nouvelle portion inutilisée.

Et transférez le bloc à la pince. Déverrouillez la machine et commencez à tailler à cinq micromètres par section. Utilisez une pince à épiler pour transférer la section au bain d’eau de 40 degrés Celsius et laissez-la s’étendre.

Trempez une glissière verticalement dans l’eau pour transférer la section sur elle. Observez ensuite la diapositive sous un microscope à champ lumineux pour vous assurer qu’un organoïde est présent dans la section. Cuire au four toute la nuit à 45 à 50 degrés Celsius, puis procéder à la coloration comme décrit dans le manuscrit.

Commencez cette partie de l’expérience avec des puits inutilisés de la plaque enrobée de gel matricielle de 96 puits avec organoïdes. En pipetant contre le côté du puits, en laissant de l’espace entre les médias et le gel matriciel, retirez soigneusement autant de supports que possible sans perturber la culture organoïde. Utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres, pré-humide avec PBS pour dessiner une goutte de gel matricielle qui contient les organoïdes d’intérêt.

Distribuez la goutte au milieu d’une glissière de chambre. À l’œil nu, aspirer l’excès de liquide multimédia et matriciel de la glissière de chambre à l’aide d’une pipette à pointe fine. Promouvoir l’adhérence organoïde au verre et prévenir la perte d’échantillons lors des étapes de lavage subséquentes.

Placez la glissade dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes. Pipetage lentement pour empêcher le détachement du plat, ajouter 200 microlitres de 1X PBS pour laver les organoïdes pendant cinq minutes à température ambiante avec des secousses douces. Retirez soigneusement le 1X PBS et ajoutez 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde.

Fixer pendant 30 minutes à température ambiante avec des secousses douces. À la PFA, lavez et procédez aux étapes subséquentes de perméabilisation et de coloration décrites par ce protocole. Montage et image immédiatement.

La diapositive fraîchement coupée non tachée montre clairement les organoïdes primaires humains de prostate, alors que dans la glissière sèche non tachée, les organoïdes semblent translucides et sont plus difficiles à détecter sous un microscope lumineux de champ. La coloration d’hématoxyline et d’éosine montre un organoïde primaire cassé de prostate humain de la mauvaise manipulation, tel que le pipetting agressif, le protocole erroné de traitement comparé à un organoïde bien manipulé. L’organoïde primaire humain de prostate était formalin-fixe, paraffin-incorporé, sectionné, et souillé avec la cytokératine basale 5 et la cytokératine luminale 8, p63 basal et cytokeratin luminal 8, et imaged avec le microscope confocal.

Un organoïde primaire entier de prostate humain a été souillé avec la cytokeratine basale 5 ou la cytokératine luminale 8, et contre-taché avec la phalloidin et le DAPI, et photographié avec le microscope confocal. Un organoïde primaire de cellules de prostate humain entier-monté a été souillé avec l’Edu fluorescent-étiqueté et contre-taché avec Hoescht, et imité avec le microscope confocal. Il est important de visualiser vos organoïdes tout au long de la procédure.

Après avoir recueilli les sections, assurez-vous de visualiser les échantillons sur la diapositive, et assurez-vous d’observer les organoïdes pendant le montage entier. Après avoir recueilli les organoïdes du gel matriciel, vous pouvez les monter et utiliser des analyses commerciales, ou se dissocier à des cellules simples pour la cytométrie du flux ou le séquençage à cellules simples. La culture 3D offre aux chercheurs une nouvelle façon d’étudier les tissus dans le cadre d’un plat de laboratoire.

Il peut être appliqué à l’organogenèse, ou à la compréhension de la pathologie de la maladie d’un patient. Lorsque vous travaillez avec des échantillons de patients, faites toujours preuve de prudence et manipulez les matériaux comme étant potentiellement exposés à des agents pathogènes transmissibles par le sang.