Induction et notation de la maladie de graft-Versus-Host dans un modèle xénogéné de murine et quantification des cellules t humaines dans des tissus de souris utilisant PCR numérique

Ce protocole décrit comment induire la maladie xénogreffe-contre-hôte, ou xenoGVHD, et comment aveugler et normaliser la notation clinique pour assurer des résultats cohérents. Le modèle xenoGVHD fournit une méthode in vivo pour tester les thérapies immunosuppressrices contre les cellules T humaines plutôt que murines, améliorant la traduction de ces études à la clinique. Amara Seng, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.

Un jour avant l’injection, placez des souris scid gamma diabétiques non obèses âgées de huit à 12 semaines, ou NSG, souris dans une cage à tarte stérilisée, et irradiez les souris dans une source de césium-137 avec une dose totale de 150 centigrays, avec une rotation lente pour assurer une irradiation même. Ensuite, placez les souris dans des cages propres dans une armoire de biosécurité stérile pendant la nuit. Le lendemain matin, recueillir suffisamment de sang humain sain pour isoler 1,1 fois 10 aux sept cellules mononucléaires périphériques du sang, ou PBMCs, par souris, et diluer le sang héparinisé dans un volume égal de 2% sérum bovin fœtal, ou FBS, dans PBS.

Superposez soigneusement jusqu’à 25 millilitres du sang dilué sur 15 millilitres de milieu de gradient de densité de séparation des lymphocytes dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation du gradient de densité. À la fin de la séparation, récolter le PBMC à l’interface, et laver les cellules en 10 millilitres de PBS dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Aspirer le surnatant, et feuilleter le tube pour desserrer la pastille.

Resuspendez les PBMCs en 10 millilitres de PBS frais pour une autre centrifugation, suivie d’une resuspension en cinq millilitres de PBS frais pour le comptage. Ensuite, recueillir les cellules avec une centrifugation finale, et résuspendre la pastille à une fois 10 pour les huit PBMCs par millilitre de concentration de PBS. Pour la livraison rétro-orbitale du PBMC humain isolé dans l’œil de la souris, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 28 avec 100 microlitres de cellules.

Confirmez un manque de réponse au pincement des orteils et retenez doucement la souris avec le pouce et le majeur. Insérez l’aiguille côté biseauté vers le bas, latéralement dans le canthus médial, à travers la membrane conjonctivale jusqu’à ce que l’arrière de l’œil soit atteint. Rétractez légèrement l’aiguille et injectez lentement tout le volume des cellules.

Puis, rétractez complètement l’aiguille pour l’élimination appropriée de la seringue et de l’aiguille. Fermez la paupière et appliquez une légère pression sur le site d’injection à l’aide d’une éponge à gaze. Ensuite, examinez le site d’injection pour l’enflure ou tout autre traumatisme visible, et permettez à la souris de reprendre conscience dans une cage stérile tapissée de serviettes en papier et de surveillance avant de déplacer l’animal dans sa cage d’origine.

Pour mesurer le score GVHD, placez la cage dans un capot d’écoulement laminaire et retirez la nourriture et l’eau de la cage. Pour marquer l’activité, observez le comportement des souris pendant cinq minutes. Pour obtenir un score de perte de poids, pesez chaque souris dans un bécher en verre.

Pendant que la souris est encore dans le bécher, inspectez l’animal pour la posture, la texture de la fourrure et l’intégrité de la peau. Après la récolte des tissus d’intérêt, couper un morceau de tissu d’environ trois par 0,5 millimètre de l’organe, et peser l’échantillon sur un équilibre. Transférer le tissu pondéré dans un tube stérile de 1,5 millilitre et congeler l’échantillon dans de l’azote liquide pour un stockage de nuit à moins 80 degrés Celsius.

Le lendemain matin, décongeler les échantillons avant la lyse, selon les instructions d’une trousse d’isolement de l’ADN génomique. Pour la quantification des lymphocytes T humains par réaction en chaîne numérique de polyméseau, ou PCR, préparez des réactions pcr numériques selon le protocole pour les té à liaison d’ADN pour la machine PCR numérique utilisée et en utilisant les amorces appropriées pour l’ADN génomique epsilon CD3 humain. Ensuite, effectuez la réaction PCR numérique dans les conditions de réaction appropriées.

Les souris NSG de huit à 12 semaines irradiées sublétales des deux sexes qui reçoivent le PBMC humain commencent à montrer des signes cliniques de GVHD autour du jour 10 après injection comparées aux souris témoins négatives traitées avec PBS seulement. Les souris XenoGVHD ont une survie médiane de 23,5 jours. À l’aide d’un PCR numérique, des lymphocytes T humains cd3 positifs à l’epsilon peuvent être détectés dans les échantillons pulmonaires et hépatiques de souris qui reçoivent des PBMCs humains.

Il est essentiel que la notation soit effectuée de façon cohérente et que le chercheur qui marque les souris soit aveuglé par leur traitement. Après cette procédure, le sérum peut être recueilli à partir de souris euthanasiées pour l’analyse périphérique d’expression de cytokine, et les cellules immunitaires peuvent être rassemblées de la rate pour l’analyse par cytométrie de flux.